ژنتیک مولکولی

ژنتیک مولکولی

اسلاید 1: ژنتیک مولکولی Molecular Genetics

اسلاید 2: مقدمه:1- کاربرد تکنیکهای جدید ژنتیک مولکولی که امکان آنالیز جزئی ژنهای طبیعی و غیر طبیعی را فراهم ساخته است انقلابی در روشهای تشخیصی و درمانی در بیماریهای ژنتیکی بوجود آورده است.2- برای انجام تحقیق بر روی اساس مولکولی بیماریهای وراثتی دو مانع اساسی وجود دارد. الف- بدست آوردن مقادیر کافی DNA و RNA. ب- خالص سازی توالی مورد نظر از دیگر قطعات ِDNA یا RNA موجود در سلول.3- این دو مانع توسط تکنیکهای استخراج DNA و واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction = PCR) قابل برطرف شدن هستند.

اسلاید 3: استخراج DNA

اسلاید 4: کاربردهای استخراج DNAجهت انجام بررسی های مختلف در زمینه امور1- تشخیصی2- تحقیقی3- مهندسی ژنتیك ضرورت استخراج A‌DN از نمونه های مورد نظر وجود دارد.

اسلاید 5: استخراج ژنوم اساس استخراج ژنوم شامل مراحل زیر است:1- آماده سازی نمونه2- از بین بردن دیواره سلولی یا لیز كردن سلول ها 3- جدا كردن مواد غیر از DNA 4- تغلیظ DNA

اسلاید 6: آماده سازی نمونه ها 1- در این مرحله با توجه به نوع سلول یا بافت مورد نظر اقدام به تهیه مقادیر مناسب از آن میشود. به عنوان مثال جهت استخراج DNA از باكتریها لازم است ابتدا مقادیر لازم از آنها را كشت داد.2- اغلب باکتریها بدون هیچ مشکلی در یک محیط کشت مایع (broth culture) رشد میکنند.

اسلاید 7: 3- محیط کشت با دور نسبتاً پایین (مثلاً 8000 rpm برای 10 دقیقه) سانتریفوژ شده، مایع رویی دور ریخته شده و رسوب حاصل در مایع مناسبی معلق میگردد.

اسلاید 8: شكستن دیواره سلولی و یا لیز كردن سلولها روشهای لیز سلولی به دو روش كلی فیزیكی و شیمیایی تقسیم می شوند. 1- در روش فیزیكی با استفاده از فشار مكانیكی دیواره سلولی شكسته می شود. مثل استفاده از ذرات شیشه، سونیكاتور (امواج ماوراء صوت با انرژی بالا) و فشار مكانیكی از طریق عبور خمیره سلولی از یك مجرای بسیار باریك تحت فشار بسیار بالا (French Press) كه اغلب در ابعاد صنعتی استفاده می شود.2- در روش شیمیایی با توجه به نوع ماده موجود در دیواره سلولی كه در انواع باكتریهای گرم مثبت و گرم منفی متفاوت است از مواد مختلفی استفاده می شود. در E.coli و انواع مشابه آن كه بیشترین كاربرد را در مهندسی ژنتیك دارند برای سست كردن دیواره سلولی از آنزیم Lysozyme یا ماده EDTA و یا هر دو استفاده می شود.

اسلاید 9: 3- لیزوزایم آنزیمی است که تركیبات پلیمریک را كه سبب استحكام دیواره های سلولی می شوند هضم می كند. EDTA نیز با جذب یون منیزیم كه عامل اساسی در حفظ استحكام پوشش سلولی است و سبب ممانعت از هضم DNA سلولی توسط آنزیمهای داخلی می شود، موجب سستی دیواره سلولی میگردد.4- با اضافه كردن مواد دترجنت مانند SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) که جزء مواد متصل شونده به چربی است این ماده با اتصال به ملكولهای چربی دیواره سیتوپلاسمی سبب انفصال و در نتیجه پاره شدن آن می شود.

اسلاید 10: 5- از آنجا که در اغلب سلولهای جانوری دیواره سلولی وجود ندارد در اینموارد کاربرد تنها دترجنت برای این مرحله کافی است. در سلولهای گیاهی نیز لیزوزایم بی تاثیر است و در آنها غالباً از روشهای مکانیکی مثل هاون کردن متریال منجمد برای شکستن دیواره سلولی استفاده میشود.

اسلاید 11: جدا كردن مواد غیر از DNA برای این منظوراز روشهای زیر میتوان استفاده كرد.1- سانتریفوژ كردندر این حالت ذرات درشت، قطعات دیواره سلولی و مواد ذره ای دیگر رسوب كرده، پروتئین ها، DNA و RNA در مایع رویی قرار می گیرند.

اسلاید 12: 2- استفاده از فنل و كلروفرم فنل و كلروفرم سبب رسوب پروتئین ها شده ولیDNA وRNA در محلول رویی باقی می مانند. با انجام سانتریفوژ دو لایه تشكیل می شود كه پروتئین ها در بین این دو لایه به شكل یك قشر سفید رنگ تجمع می یابند. در مواردیکه مقدار پروتئین عصاره سلولی بسیار بالاست بهتر است قبل از مرحله فنل و كلروفرم از آنریم های تجزیه كننده پروتئین مانند Proteinase K یا Pronase استفاده كرد تا با شكستن پلی پپتیدها به قطعات كوچكتر براحتی توسط فنل رسوب داده شوند.

اسلاید 13: 3- استفاده از نمكهای رسوب دهنده پروتئین برخی املاح مانند استات سدیم و پتاسیم سبب رسوب پروتئینهای موجود در مخلوط لیز سلولی می شوند. در این روش با اضافه كردن این املاح به لیز سلولی، مخلوط پروتئینها و ذرات دیگر رسوب می كنند كه پس از سانتریفوژ كردن بشكل توده ای سفید رنگ در ته لوله مشاهده میشوند. مایع شفاف رویی حاوی DNA و RNA و مقداری پروتئینهای باقیمانده است كه میتوان با روش قبلی (فنل – كلروفرم) اقدام به رسوب آنها نمود.4- استفاده از ریبونوکلئازجهت حذف RNA می توان از ریبونوکلئاز (Rnase ) استفاده کرد.

اسلاید 14: تغلیظ DNA 1- در مواردیکه نیاز به تغلیظ DNA وجود دارد عموماً از متد ethanol precipitation استفاده میشود. 2- در دمای -20 اتانول مطلق سبب رسوب اسیدهای نوکلئیک پلیمریک میگردد. اضافه كردن مقدار هم حجم اتانول و نگهداری نمونه در دمای سرد سبب رسوب DNA میگردد كه جهت تكمیل این مرحله از سانتریفوژ دور بالا استفاده می شود (15- 14 هزار دور در دقیقه به مدت 10 تا 25 دقیقه).

اسلاید 15: 3- سپس با خالی كردن لوله ها، رسوب با اتانول 75% شسته شده و در خلاء در دمای اتاق خشک میگردد. 4- حل کردن DNA خشك شده در حجم مناسبی از آب یا بافر باعث تغلیظ DNA میگردد. 5- بعلاوه این روش باعث حذف اسیدهای نوکلئیک با زنجیره کوتاه و منومریک میگردد. بدین ترتیب RNAهای حاصل از ریبونوکلئاز در این مرحله حذف میگردند.

اسلاید 16: اندازه گیری غلظت و خلوص DNA 1- غلظت DNA میتواند بطور دقیق توسط ultraviolet absorbance spectrophotometry اندازه گیری شود. 2- در طول موج 260nm، هر 1 واحد absorbance معادل 50 میکروگرم مولکول دو رشته ای DNA در میلی لیتر است. 3- در مورد یک سمپل خالص DNA نسبت جذب در طول موج 260nm و 280nm برابر 8/1 است. نسبتهای کمتر از 8/1 بیانگر آلوده بودن محلول به پروتئین یا فنل است.

اسلاید 17: واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction = PCR)1- PCR راهی برای تولید مقادیر نامحدودی از توالی مورد نظر است. PCR میتواند یک مولکول DNA یا RNA خاص را در عرض چند ساعت تا چند میلیارد برابر تکثیر کند به همین دلیل PCR توانسته است در زمینه تشخیص و آنالیز بیماریهای ژنتیکی انقلابی بوجود آورد.

اسلاید 18: 2- PCR تکثیر آنزیمی قطعه ای از DNA است که بین دو اولیگونوکلئوتید بنام پرایمر (primer) قرار گرفته اند. پرایمرها طوری طراحی میشوند که یکی از آنها مکمل یک رشته در یک طرف توالی هدف و پرایمر دیگر مکمل رشته دیگر در طرف دیگر توالی هدف باشند. انتهای 3’ هر پرایمر به سمت توالی هدف میباشد در نتیجه توسط DNA پلیمراز در آن جهت طویل میگردد.

اسلاید 19: 3- سیکلهای مکرر دناچوره شدن حرارتی، هیبریداسیون پرایمرها و سنتز DNA منجر به افزایش تصاعدی توالی هدف میگردد. PCR تکنیکی فوق العاده حساس میباشد. آنالیز حتی میتواند بر روی یک سلول منفرد از ریشه مو یا یک سلول موجود در آب دهان انجام گیرد. بنابراین PCR نیاز به تهیه مقادیر بالای DNA از نمونه های بافتی را مرتفع کرده است.4- PCR اکنون به روش استانداردی برای آنالیز نمونه های DNA و RNA در آزمایشگاههای تحقیقاتی، تشخیصی و پزشکی قانونی تبدیل شده است. PCR سریعتر، ارزانتر و حساستر از دیگر روشهای آنالیز اسیدهای نوکلئیک است.

اسلاید 20:

اسلاید 21:

اسلاید 22: تعیین توالی DNA (DNA sequencing)

اسلاید 23: روشهای تعیین توالی DNA1. Chain Terminating nucleotides (Sanger)2. Chemical Degradation (Maxam-Gilbert)3. Pyrosequencing4. Shotgun Sequencing

اسلاید 24: 1- روش Chain Terminating nucleotides ((Sanger-Coulson1- گسترده ترین روش مورد استفاده برای آنالیز توالی DNA، تعیین توالی سانگر میباشد. (Sanger و Gilbert در سال 1980 برای ابداع روشهای تعیین توالی DNA جایزه نوبل گرفتند.) 2- در این متد که در آن از DNA تک رشته ای استفاده میشود، در محیط واكنش علاوه بر داكسی نوكلئوتیدها (dNTP) از نوكلئوتیدهای اصلاح شده ای بنام دی داكسی نوكلئوتیدها (ddNTP)‌ نیز استفاده می گردد. این نوكلئوتیدها نیز می توانند مانند نوكلئوتیدهای معمولی در رشته در حال سنتز وارد شوند ولی از آنجا كه جایگاه 3’ قندشان فاقد گروه هیدروكسیل است (یعنی OH تبدیل به H شده است) از ادامه یافتن سنتز رشته جلوگیری می كنند.

اسلاید 25:

اسلاید 26:

اسلاید 27:

اسلاید 28:

اسلاید 29:

اسلاید 30:

اسلاید 31:

اسلاید 32:

اسلاید 33: 2- Chemical Degradation Method (Maxam-Gilbert)1- دراين متد از DNA دو رشته اي استفاده ميشود. این روش چون بر پایه سنتز نیست در آن به پرايمر نيز نياز نمیباشد. 2- در این روش ابتدا DNA دو رشته اي مورد نظر از طريق اتصال يك گروه فسفات راديو اكتيو به انتهاي 5’ هررشته نشاندار مي شود. (برای نشاندار كـردن رشتــه ها مــی بــایست درمـــرحله سنتــز رشتـــه ها از داكسـی نوكلئوتیدهای رادیواكتیو مثل 32p-dNTP استفاده کرد). 3- با حرارت دادن سمپل دو رشته ازهم جدا شده و بوسيله ژل الكتروفورز تفكيك ميگردند. (چرا كه احتمالاً يكي از رشته ها بدليل دارا بودن پورین بيشتر، سنگينتر است).

اسلاید 34: 4- يكي از باندها را از ژل جدا كرده و 4 قسمت مي نمائيم . با افزودن 4 ماده شیمیایی مختلف به هريك از 4 سمپل تغییرات شيميايي درنوكلئوتيدهاي اختصاصي هريك ايجاد مي گردد بطوريكه براي cleavage مستعد مي گردند. 5- با افزودن يك تركيب شيميايي بنام Piperidine به هر4 سمپل، یک cleavage در هر رشته ايجاد میگردد. از دو رشته حاصل ازcleavage فقط يكي دارای 32P بوده و قابل مشاهده در اتوراديوگرافي ميباشد.6- ازاينجا به بعد همانند روش سانگر است يعني 4 گروه را همزمان الكتروفورز كرده و توالي نوكلئوتيدها را مي خوانيم. با اين متد هم همانند متد قبلی حدود 400 نوكلئوتيد قابل خواندن است.

اسلاید 35:

اسلاید 36: 3- Pyrosequencing1- شایعترین نوع تفاوتهای توالی در ژنوم انسان SNPs یا پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی هستند. بطور متوسط حدود یک SNP در هر هزار باز از کروموزومهای انسان وجود دارد. Pyrosequencing روشی جدید برای آنالیز سریع، دقیق و باصرفه SNPها فراهم کرده است.2- این روش که توسط Nyren سوئدی در اواسط دهه 1990 بوجود آمد بر پایه سنجش Bioluminescent پایروفسفیت (PPi) که بطور طبیعی در طی سنتز DNA آزاد میشود استوار است. 3- در این روش یک پرایمر اختصاصی بر روی DNA تک رشته ای نزدیک SNP مورد نظر آنیل میشود. سپس مخلوط آنزیمها و سوبستراهای مورد استفاده به نمونه افزوده میشود. سپس چهار dNTP مختلف بطور متوالی به واکنش افزوده میشوند. اگر dNTP اضافه شده مکمل باز بعدی در رشته Template باشد توسط آنزیم DNA پلیمراز بداخل رشته در حال رشد DNA وارد شده و منجر به آزاد شدن PPi میگردد. PPi آزاد شده باعث براه انداختن یک آبشار آنزیماتیک میگردد که نهایتاً ایجاد ضربان نوری (light pulse) مینماید که بصورت پیکی در پایروگرام ثبت و نمایش داده میشود. شدت ضربان نور که بصورت ارتفاع پیک در پایروگرام نشان داده میشود با تعداد بازهایی که بداخل رشته DNA وارد گردیده اند نسبت مستقیم دارد.

اسلاید 37:

اسلاید 38:

اسلاید 39: 4- Shotgun Sequencingاكثر ژنها خيلی بلندتر از 400 نوكلئوتيد طول دارند. برای sequence كردن آنها مي بايست آنها را به قطعاتی كه با هم overlap دارند تقسيم كرده و پس از sequence كردن تك تك قطعات و كنار هم قرار دادن قطعات مجاور، sequence كامل ژن مورد نظر را بدست آورد. راههای مختلفی برای ايجاد قطعات همپوشان وجود دارد مثلاً قطع كردن ژن با دو آنزیم محدود کننده مختلف مثل Sau3A و AluI. ازآنجا كه ممكنست بعضی قطعات حاصل بيش از حد بلند بوده وامكان خواندن آ‌نها نباشد اغلب مجبور خواهيم بود از چهار یا پنج آنزیم محدود کننده مختلف برای این منظور استفاده نمائيم.