کریسپر

صفحه 1:


صفحه 2:
Yb wea >< معحبوى ويرايش ژنوم تاریخچه وبرایش ژنوم انواع قیچی های محلی مکانیسم ویرایش ژنوم جدول زمانی ۳۱5۳1 موارد اکتشاف. 6859 6۴۱5۳۴ چیست؟ اجزای اصلی ‎CRISPER‏ سیستم ‎CRISPR‏ طبیعی 1528 به عنوان یک ابزار ژنومیک پروتکل عمومی ۱ پیشرفت های اخیر ۳ مزایاو محدودیت ها ۳مباحث اخلاقی ۴مطالعات موردی ۵ چشم اندازهای آینده ۶منابع نتیجه گیری 

صفحه 3:
* _درسال ۰1987 3202! و همکارانش حین مطالعه بر روی آنزیم 20 متوجه شدند که در پایین دست این ژن» توالی های تکراری و غیرتکراری وجود دارد. * . فرانسیسکو موهیکا توانست در سال ۱۹۹۳ در خصوص کریسپر و عملکردهای آن به نتایج مهمی برسد. مطالعات در سال ۲۰۰۲ نشان داد که اين قسمت های تکراری به صورت پالیندرومی هستند و همچنین به طور متداوب تکرار شده اند و بوسیله قسمت های غیرتکراری به نام 5۳0366 از هم جدا شد ه اند که اسم این نوع آرایش ژنی را ۱5۹م) گذاشتند که مخفف 4.1 Clustered Regular Interspaced short Palindromic Repeat تسدریج دانشمنلانسه بسرسی‌دقیوتسر کریسپر مشغول‌شدند * تا در سال ۲۰۰۵ توانستند به خوبی آن را درک کنند. محققی به نام الکساندر بولوتین توانست پروتتین 6.354 را کشف کند که یک آنزیم برای برش دی انای به‌شمار می‌رود و اين توانایی را به محققان می‌هد تا بتوانند ژنوم را در سلول ویرایش کنند. 

صفحه 4:
با وجود مطالعات فراوان صورت گرفته بر روى سيستم -091588 9 یک تکمی دیگر پازل باتی‌مانده بود. لین تکه قطعه‌ای کوچک به نم ۴۱۷۸ 0۳۴۱5۳۴ 1۵09-201۷219 يا ‎tracrRNA‏ بود که ‎Emmanuelle Charpentier) 21s Jog) p25 &‏ ¢ به‌طور اتفاقی کشف شد. دو دانشمند به نام های اماتوئل شارپنتیه و جنیفر دودنا در مورد «توسعه روشی برای ویرایش یا مهندسی ژنوم» تحقیق کرده اند. شارينتبيه فرانسوى و داودنای امریکایی در سال ۲۰۱۲ شیره ویرایش ژنوم موسوم به کریسپر ((۱5۳) را کشف کردند. کمیته جوایز نوبل گفته است که کشف این دو دانشمند پیشرفتی است که «علوم زیستی را وارد یک عصر جدید می‌کند»به پاس توسعه‌ی فناوری ویرایش ژین کریسپر که امروزه تقریبا در تمامى علوم كاربرد دارد؛ جایزه نوبل شیمی ۲۰۲۰ را از آن خود کردند. ۳ ۹ Emmanuel! Charpenti r 

صفحه 5:
2007: 1" experimental evidence of CRISPR for adaptive immunity. 2005: Identified foreign origin of ‘spacer sequences. 2013: First demonstration ‘of Caso genomic engineering in eukaryotic cells 2012: In vitro characterization of DNA targeting by ‏وت‎ ‎ae‏ یی ‎2002: The term "CRISPR’ was coined ‎2000: ‎Recognized ‎presence of sequence throughout prokaryotes. 2011: Modular CRISPR systems that con be ‎heterologously ‎‘expressed in other cergenieme. ‎2010; Cos9 is ‘quided by spacer sequences and Cleaves torget DNA by double strand break, ‎1987: First report of clustered repeats. ‎2008: CRISPR ‘acts on DNA targets. Spacers converted into “guide’ RNAs. ‎ ‎ ‎ ‎ 

صفحه 6:
Learn more at rarediseases.org TLINSIGHTS Mast rare diseases aye geneticorhavea ‘genetic component. ‏اه فماهونای كا‎ سم 0 كن كه با 3 سای MANY RARE DISEASES 7,000 ra more than worldwide ases that affect * Anestimated 30 people in the U.S. are living with rare diseases. ٠ Yet, despite this high prevalence, there are approved drugs for 

صفحه 7:
‘Adenovector 0 gene 1 1 Up YY Corrected gene Defective gene ~ چٌن درملنی در اولیل دهه ۱۹۹۰ آغاز شد و روشی جدید در پزشکی مولکولی محسوب میشود ین ترلپی روشی برای درمان بیماريهابه وسیله جایگزینی ین معیوب و یا معرفی ین جدید برای درمان. در حال حاضر به پیوسته و بطور قطع ین درمانی برای انسان یک راه موثر در قرن ۲۱ به شمار میرود. سیستم ۱5۳۴6/۵59 در حال حاضر روشی ساده. دقیق و تطبیق پذیر وکا رآمد و با پتانسیل بالا برای دست ورزی ژنتیکی است است که قابلیت کنار زدن و جایگزینی با روش های قدیمی مانند 2106 ۴۱096۲ و 111 را دارد. bttps://www. google.com/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fwww.genome.gov%2Fgenetics-glossary%2FGene- Therapy&ipsig=AOvVaw054F6yaN4Y82QsA- 

صفحه 8:
eee} SC) ‏شنم‎ است که در ‎Gl‏ /201] با استفاده از نوکلتازهای مهندسی شده یا "قیچی ‎JA‏ ۱ 0 ‎Pe ۳۹ "‏ مولکولی در ژنوم موجود زنده وارد . fil Ea ‏حذف یا جایگزین می شود.‎ انواع قیچی های ملوکولی اختصاصی 

صفحه 9:
مروری بر مسیرهای ترمیم ۸۵( سه نوع ساز و کار اصلی برای ترمیم دنا وجود دارد: * ترمیم برگشت مستقیم آسیب ‎Direct Reversal of the Damage‏ * ترمیم برش 860۵1۲ 85100 * ترمیم پس از هماننسازی ‎Post replication Repair‏ مسیرهای اصلی ترمیم 0۱18عبارتند از: * ترمیم عدم تطابق (0۸۳۸۶) | سه مکانیسم اول. برای ترمیم آسیب‌های تک‌رشته‌ای به کار گرفته می‌شوند. * ترمیم برش نو * ترمیم برش باز آلی (8۴0) 3 * ترمیم نوترکیبی همولوگ (۲۱8) | اگرهر دو رشته دناه دچار آسیب شده باشند. سلول, از یکی از دو مکانیسم 18یا 4 [ع1 الالبراى ترميم ناحيه صدمه ديده. کمک خواهد گرفت. * بيوند انتهابى ‎(NHED) Spat poe‏ 

صفحه 10:
درمتم نوترکیبی همؤلوى رای نوترکیبی همولوگ. شکاف‌های دو رشته‌ای 00۷۸ ناشی از تشعشعات یونیزان یا مواد شیمیایی آسیب رسان ‎DNA a‏ را ترمیم می‌کند. در صورت عدم ترمیم. اين شکستگی‌های دو رشته‌ای می‌توانند باعث بازآرایی منطقه بزرگی از کروموزوم شوند. که به نوبه خود. عوارض جدی» مثل سرطان را در پی خواهد داشت. ترمیم ‎۳۱٩‏ رایج‌ترین نوع از «ترمیم وابسته به همولوزی» (0ععع]1(ا-لاوهاهممهلا ۳ است که به اختصار. ‎HDR‏ نامیده می‌شود. HOMOLOGOUS RECOMBINATION DAMAGED DNA "<< سح UNDAMAGED TEMPLATE 

صفحه 11:
پیوند اتتهایی غیر همولوگ ‎LL‏ این مکانیسم ترمیم نیز برای تعمیر شکاف‌های دو رشت‌ای دنا )| ‎Double (Strand Break‏ (085 طراحی شده است. [848به طور معمول, توسط توالی‌های 00818 همولوک كوتاد, به نام «ریزهمولوی» (( 09/65 1/116۳۵1010101) هدلیت می‌شود. لین ریزهمولوژی‌ها اغلب‌سبه صورت يك دنباله تك رشتهاى. در انتهای شکافهای دو رشته وجود دارند. هنگامی که برآمدگی‌های دو رشته دنا. كاملاً با هم مكمل باشند. 80141 معمولاً شکست را با دقت ترمیم می‌کند. البته ترمیم نادرست نیز ممکن است رخ دهد. که منجریبه از دست دادن نوکلئوتیدها خواهد شد. اما اين اتفاق. به ويزه زمانى ديده مى شود که دو دنبله تک رشته‌ای, در تعام طول خود. مکمل هم نباشند. 8011 تامناسب می‌تواند منجربه جابجایی و همجوشی تلومر شود. که از مشخصات اصلی سلول‌های توموری است. غالا نی عه قق سیب بیس سول به جای اسظانبزا: تیوه مریم مسد با ودود ضایعه,به همانندسازی و تکثیر. ادلمه دهد. اگرچه لین آمر. ممکن است‌به جهش منجر شود. اما بر متوقف شدن در مرحله همانندسازی, ارجح است: چرا که اين توقف. موجب مرگ سلول خواهد شد. —— از شکست دو رشته‌ای ‎HE Sue‏ اتصال يليائهها - ‎Ss‏ = ۱ ۱ هام به ليكاسيون كروماتيد خواهرى ۱۱ 

صفحه 12:
نوکلتازها شکست های دو رشته ای خاص ‎DSB)‏ را در مکانهای مورد نظر در ژنوم ایجاد می کنند و مکانیسمهای ویرایشی درون زای سلول را تحث کفترلل میگیرند: فا شکست: ناشی از فرآیندهای طبیعی ترکیب مجدد همولوگ ‎(HR)‏ ‏و اتصال غیر همولوگ ([۱۱۳۱۴ را ترمیم کند. CO ere Nonhomologous end joining (NHEJ) Homology directed repair (HOR) 1711101111]1111111۳۳۳1۳11۳11۳۳۲ 1019۳۵۵۵۳ ۱ ع اسم ای لاسام 1 Precise alteration/correction ۱ Knockout Knockin 

صفحه 13:
تکنیک نی کربسپر برای مهندسان زیستی همچون یک ابزار برش و چسباندن است. کریسپر به توالی‌های غیر معمول دی‌ان‌ای گفته می‌شود که به ارگانیسم‌ها برای شناسایی تهدیدها - خصوصا ویروس‌ها - کمک می‌کند. نام اين روش مخفف تناوب‌هاي کوتام پالیندروم فاصله‌دار منظم خوشه‌ای است. در توالی دی‌ان‌ای. خوشه‌ها در فواصل مشخصی از هم قرار می‌گیرند و پالیندروم ها در تکرارهای کوتاه با تفییرات اندکی بارها و بارها تکرار می‌شوند. دانشمندان با استفاده از این تکنیک. می‌توانند ژن‌های مشخصی را از یک زنوم بردارند و آن را با یک ژن دلخواه جایگزین کنند. CRISPRICas system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 

صفحه 14:
مقدمه‌ آی بر 1۲5۳1/۵59 توانایی ویرایش دقیق و هدفمند هر نقطه ای از ژنوم موجودات برای سالهای طولانی آرزوی دانشمندان بوده است. و امروزه دانشمندان بیش از گذشته به این هدف نزدیک شده اند. با كشف سيستم 8289© 011521 ‎(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat CRISPR Associated Protein 9)‏ « دانشمندان اکنون قادر به خاموش کردن 000-0 و وارد کردن (11006-18) هر ژنی در هر نقطه ای از ژنوم می باشند. ویرایش ژنوم بر اساس سیستم 0089 01815118 یک ابزار کارآمد و با پتانسیل می باشد که قادر به کنار زدن و جایگزینی با روشهای قدیمی ‎Finger sls‏ 2106 و ات1۸1 را دارد. 

صفحه 15:
برای اولین بار در باکتری ها و آرکثی ها 0859 01115216 به عنوان یک سیستم ایمنی میکروبی شناخته شد که توسط اين سیستم این موجودات ایمنی اکتسابی را بر علیه ویروسها و پلاسمیدهای مهاجم کسب می کنند. جایگاههای نی کربسپر در۴۰ درصد باکترو توللی یابی شده توللی یلبی شده مشاهده شده است. و بیش از یک جایگاه در باکتری ها می تولند برای آن وجود داشته باشد. در هنگام ورود 121۸ خارجی مهاجم به درون باکتری, ‎DNA ep!‏ توسط آنزیم های نوکلئازی 0۵5 شکسته می شود و سپس بخشی ازلن در جایگاه کریسپری و بین دو توللی تکراری قرار می ‎fa‏ كه در این حالت به آن 5036۲ گفته می شود. توالی های 5036۲ به عنوان الگوههایی به منظور تولید توالی های ‎۲٩0۷۵‏ کوتاه کریسپری (۲۳۹۷۸)مورد استفاده قرار گرفته و کمپلکسی را با مولکول ‎trans-activating- CrRNA ctracrRNA)‏ 

صفحه 16:
rRNA ۳ . تعاریف و اصطلاحات ‎ae‏ * Contains the guide RNA that locates the correct section of host DNA along with a ‏ريف و‎ ‏رالیهعی) شلالای‌تا ما كلمتط تحط ومتعم‎ in a hairpin loop form) forming an act complex. ‏سس‎ ‎(0 GT CTAA racRNA ww * Binds to cRNA and forms an active complex. seRNA * Siete guide RNAs are a combined RNA consisting of a trciRNA and a least one cd وت ‎Protein whose active form i:‏ » ‎differing functions (i.e. si‏ ‎due to Cas9's DNA.‏ able to modify DNA. Many variants exist with igle strand nicking, double strand break, DNA binding) le recognition function. EE ‏اللتل7ل77‎ ‎VF Leader Repeat spacer Repeat spacer Repeat spacer Repeat spacer ۰ ۵۱ 

صفحه 17:


صفحه 18:
فلا ۳ 1( 2:70 1315۳8 ارایه کریسپر : شامل توایهای تکراری پالیندرمی 16۳681 که توسط نواحی 500007 از هم جدا شده اند. 2 560167108 1924107 توالی راهنما: شامل پروموتور روئویسی عناصر تکراری پالیندرمی ۲60601 است. 3 توالی کدکننده پروتئین های ‎Cas‏ (ئوکلتازهای هو ) Genes encoding Cas proteins CRISPR array as | a ‎Leader Repeat Spacer Repeat Spacer Repeat‏ — = جح ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ 

صفحه 19:
Phage infection acquisi 1 Spacer Direct repeat Generalized Cas genes ۳ ‏اقا‎ ۰ locus CRISPR array ‏عدم لي كر‎ ee Type! Type lt Type ‏قال‎ biossnenig Ses A. eat ‏و‎ =a re. * processing Target degradation 1 5 1 1۹ 

صفحه 20:
الیسم عمل سیستم 815۳10/25)شامل سه مرحله میباشد: 1- 00ا0اتره4 ۸ ندر مرحله اتطبای کمپلکس 0051/0052 براساس موتیف 2۸6 سكانس 2010509686 را در نوم ياتوئن شناسايى و برش زده ودر رایه کریسپر ین ولین احیه تکراری أر سکانس راهنما ) درج میکنند. Casi—Cas2 ۱ ۱ complex Protospacer Protospacer integration ۳ Invader DNA 251 ۳2 652 Protospacer | New spacer-repeat unit a Invader 

صفحه 21:
نحوه ی 56۲101 توالی 50366۲ Repeat spacer (a) 1 Leader” Repeat * spacer ۰ Repeat 30H 30۲ Leader Repeat New spacer Repeat 

صفحه 22:
‎ole ale y2,0: expression and maturation -2‏ 9 بلوغ ارایه کریسپر رونویسی میشود و پس از پردازش منجر به ایجاد 0801۸ ها میشود . ‎Transcribed CRISPR array rRNA crRNA-Cas RNP complex. ‎5 ۰ ‎3 ‎5 3 —- — 8 9 lArray processing 5 3 ‎ ‎ ‎ ‎ 

صفحه 23:
CRISPR-associated endoribonuclease Cas6 ) (b) pre-crRNA نحوه ی پردازش crRNAa SPACER rr 

صفحه 24:
: در مرحله تداغل 8014© و پروتین 85 تشکیل کمپلکس پروتلینی 65-611801۸داده و سلول را بمنظور یفتن توالی همولوگ با 0801۸ جستجو میکنند .از انجا که 08۸ از پاتوژن مشخص جدا ,درج و رونویسی شده بود طبیعتا مکمل توالی از همان فاژ اولیه میباشد (حافظه ایمنی) و هنگامی که به توالی مکملش متصل شد نوکلئاز 088 شروع به تخریب ژنوم قاذ میکند. . 7 دسج ‎Nose‏ ‎Target degradation‏ نو ‎Nuclease‏ ‎or domain‏ 

صفحه 25:
Blunt or Sticky Ends ‏خی سس‎ bp staggered ends ‏م‎ ends active center e762 9 Two-metal-ion Cleavage product coordination in ۳ 3 Generated by Cas9? | / ‏ف‎ ‏ل با‎ = يا ل وه 1 ‎Ruv‏ ntDNA 1 EK = ۲۳۳۳۲۳۳۳۱۲۲۱۱۱۲۲ ‏يبري‎ 5 = 0 - 1 ب | لللل 

صفحه 26:
سیستم 116013610 در باکتریها مسئول ترمیم شکست های دو رشته ای 121۸8 است. این سیستم انتهای خطی فاز یا شكست :ذو رشلثة دن يلازميد همكام.هماتندسازى .را مثاية. شکست دو رشته ای 121۸۸ خودی در نظر میگیرد و تارسیدن به تواليهاى مشخصى بنام 0111) دو رشته 1210۸ را تخریب ۱ میکند . محصول این تخریب سوبستراهای لازم برای انتخاب سس هسح ‎Spacer‏ ,| در لختير كميلكس0351/0852 قرار ‎a‏ ميدهد 7 

صفحه 27:
۹ هك" Self DNA _Chi_Chi_Chi_Chi_ Cao ‏مر‎ S ‏است توالى هاى 0111 در ياتوزن ها فاصله بسیار‎ Eligible for spacer ‏زیادی از هم دارند و طول ناحیه تخریبی در انها بیشتر است‎ acquisition ‏و سوبسترای زیادی در اختیار 851/0852 برای یافتن‎ 1 قرار میگیرد. در حالی‌که فاصله ۲۲ Foreign DNA ‏بسیار نزدیک بوده و محصول تخریب توسط‎ | ‏سي کم‌لستو سوبسترلی‌زیامیدر لختیار ات‎ 1 ‏برلويافتن508661 قرار نميكيرد‎ 2 Eligible for spacer’ quisition 

صفحه 28:
PN EON LN hey ‏پبریتنی‌جا]‎ پروتئین های آنتی کریسپر که ابتدا در برخی فاژهای سودوموناس شناسایی شدند . مانع عمکرد سیستم کریسپر در باکتریها ميشوند. تا کنون پنج خانواده انتی کریسپر پروتین در سیستم "1-3 و چهار خانواده انتی کریسپر پروتیین در سيستم 1-185 شناسايى شده اند. انواع پروتیین های انتی کرپسپر مکانیسم عمل متفاوتی دارند . ‎.١‏ برخی مانع اتصال 0۳۳۸ به توالی هدف میشوند ‏؟. برخى با اتصال به يروتئين 088 مانع عمکرد نوکلتازی آن میشوند ‎ ‎ ‎ ‎ 

صفحه 29:
تقسیم بندی سیستم های کریسپر -کاسپاز ‎٩‏ سس | er cane eonceo0n ‏سا هس‎ Type I (Cas3.Cas1 .Cas2.Cas5.Cas6.Cas7) cx B05) Type II(Cas9.Cas] .Cas2.Csn2) ‎SS ‘Type III(Cas]0.Cas6.Cas1.Cas2)‏ . ت۳۰ ‎RRR RRR OO ‎ ‎ ‎ ‎۳۹ ‎ ‎ ‎ 

صفحه 30:
تایپ ۲ سیستم ‎CRISPR/Cas‏ تايب 2 سيستم 0115۳18/05 تنها در باکترها موجود میباشد و اوکلئاز مرحله تداعل دراین تایپ نوکلاز 0269 میباشد. 6259 شامل دو دمین 1811۷6 و 11114 میباشد که هرکدام مسئول برش یکی از رشته های 2/۸ آدورشته ای است.در تایپ 2بالادست اپرون ۵ه) توالی ترنس با ارایه کریسپر بنام 5805304 قرارداردپس از رونویسی ۱2۵07181۸ با بخشی از 071814۸ جفت میشود و با 1859) بمنظور جستجوی توالی مکمل با 5۳8687 کمپلکس تشکیل میدهد .و سپس 1859) دورشته 10۸ هدف را 3 جقت باز بالادست ناحپه ‎ty PAM‏ میزند(برش بسیار دقیق و اختصاصی) D ANase i 

صفحه 31:
ee betel Solel ONS oe SM cece Type! Type ll Type lll 

صفحه 32:
سه نوع واریانت مختلف وووع عبارتند از : 1- ۷6 0ازسس ووجت : ترکلناز تیپ وحشی حاوی دو دمین ‎SSIES‏ 8۷6 و ‎HNH‏ ‎Cas9 nickase -2‏ :2905 موتاسیرن غیرفعال کننده در یکی از دمین های 8۷6 (010۸) و یا ‎(H840A) HNH‏ ‏3- 06359 : هر دو دمين اين تيب 3859© از طريق موتاسيون غيرفعال شده اندو فاقد فعاليت كاتاليتيك هستند. اين نوع 0359 ميتواند با فيوز شدن به ساير دمين هاى افكتور: براى اهداف مختلف طراحى ككردد ‎| ۱ ‘it aired Cass chases ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎۲ ۳ Nrget ‏وی‎ Aetvation ۱۷۴۷ 1 \ ‏حومه‎ ‏حك‎ — Doner On —— ewok ‎Homotoa drectee rapa (HDA ‎ ‎‘A. Genome Engiezring With C239 Huclease ‎ ‎Tew ONA ‎Nor tonoiagas, ating (MES) ‎ ‎ ‎modifications of Cas ‎ ‎ ‎rr ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ 

صفحه 33:
structure of sgRNA در سال 2012 جنیفر دودنا و همکارانش یر اسال توالی 218۳۸ و .13618314 سكالسى مشيه را در ازمایشگاه سنئز کردند و به جای توالی 5۳0007 توالی همولوگ با ناحهه هدف مورد نظر در 1(۸ را قراردادند و دو توالی سنتز شده ۸ و101۸ را با لیتکر به هم متصل کردند و ان را۸ل(88: ( 1۸(*لراهنمای تک رشته) نام نهادند. 38۱3۸ با پروتتین 859 تشکیل کمپلکس داده و پس از لیتک شدن با توالی هدف بصرت کاملا اختصاصی احیه هدف را یرش میزند. بدین ترتیب امکان استقاده از ‎CRISPR-‏ ‏دنرگ 0359 در ويرايش نوم سایر موجودات از جمله انسان فراهم شد. ide eget heeroduplen | دانشمندان موفق به طراحی نسخه جدید و قوی‌تر از ویرایش ژنی کربسپر شده‌اند 

صفحه 34:
3 تفاوت ‎sgRNA‏ شا و کمپلکس 6۲۳۱۱۵۸۲۲۵۵۲۴۱۱۵ 0259 programmed by single chimeric RNA Cas9 programmed by crRNA:tracrRNA duplex protospacer target DNA اااااااااااا 7 QUAIL { ‎INULIN 5‏ \ اس هی ال ‎= ‎ ‎(VIVIAN ‎5) ‎erRNA ‎۳۴ jo ENS ctRNA-tracrRNA chimera ‎ ‎ ‎ ‎ 

صفحه 35:
سنتز 2۳01۸ و 0289 بسته به نوع کاربرد بر اساس دو روش صورت میگیرد : 1- سنتز 21۸ بعنوان 118214 guide RNA| ‏ياسنتر همالع و0889 در يلازميد‎ -2 Expression Method _(tracrRINA + crRINA) Cas 9 Protein eee 38 8 A = ~ ‏راه های انتقال 212۸ و 089 به سلول هدف:‎ DNA Only ‏مم‎ ‎Lipofection ‎Electroporation ‎B awa Lentiviral transduction ۳ 111 Sem pot (A) 1 8 RNA Only Sen en (AAV) adeno-associated virus c eran ۳ 111 RNA and Protein cao ‏مس‎ 3 

صفحه 36:
CRISPR Cas9 - Protospacer Adjacent Motif ‎PAM‏ رما ‎2 8 Target Sequence ‎S JSS‏ موفقیت ‎ay CRISPR/CA89 jl oak! Leis tales‏ توالى 8197/1 و همجنين توالى 74191 بستكى دارد و فقط تولى ‏هدفى كه قورا بعد از تولى 2411 آمده باشد براى ويرايش رلوم هدف قرار داده مى شود ‎target pan Ill ‎ ‎ ‎ ‎ 

صفحه 37:
7 ی پروتوکل های کلی کار با ‎CRISPER‏ 

صفحه 38:
Genomic target سس سس و سم ‎(20bp)‏ ‏مامت > guide sequence ‎sgRNA backbone‏ م64 ‎Assembly of SgRNA and Caso ‎1. Select genomic target ‎a. 20 bp sequence followed by the PAM (NGG) ‎b. Use online tools to minimize off-targeting ‎2. Design sgRNA ‎a. sgRNA is expressed using asmall RNA promotor, such as Up or U3p ‎b. First nucleotide in the guide sequence is a “G", if USp is used, or an “A”, if USp is used ‎Guide sequence should match the target,‏ بع ‎except for the first nucleotide (5’ G or A) that‏ ‎does not have to match‏ ‎3. Assemble Cas9 / sgRNA construct ‎ ‎۳۸ 

صفحه 39:
4. Deliver to plants 1 a. Protoplast tranformation b. Agrobacterium transformation Delivery to plants cc. Callus bombardment 5. Regenerate and screen transgenic plants for gene editing events ‘Screening for mutants 1) Restriction Enzyme Site Loss} (b) Surveyor assay ff (c) Next Generation Sequencing (NGS) RE + CELIor 17 coc om com | | 

صفحه 40:
Optimized CRISPR Design (Feng Zhang's Lab at MIT/BROAD, USA) sgRNA Scorer (George Church's Lab at Harvard, USA) sgRNA Designer (BROAD Institute) F— A ChopChop web tool (George Church's Lab at Harvard, USA) E-CRISP (Michael Boutros’ lab at DKFZ, Germany) CRISPR Finder (Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, UK) RepeatMasker (Institute for Systems Biology) to double check and avoid © selecting target sites with repeated sequences ۲ ۲ ۷۲ ۲ Software and databases COadagene piasmid repository CasFinder E-CRISP Design of CRISPR constructs 

صفحه 41:
مکانیسم ویرایش ژنوم با استفاده از تکنولوژی ‎CRISPR/Cas9‏ A دو رشته 01۷۸ابریده شده توسط این سیستم توسط دو مکانیسم ترمیمی که در تمامی انواع ارگانیسم ها یافت می شود ومسیر ترمیمی اتصال انتهاهای غیر همولوگ ( (([۱۱۳۱۶) 010108[-600 15ا۱0۲0-0۲001080او مسیر ترمیمی شباهتی ((۲۵۴) ۲60۵1۲ ۱۵۳0۵۱۵8۷-۵1۲66۲60)نام دارند, ترمیم می شود. 

صفحه 42:
‘genomic DNA wild-type Cas9 protein target sequence (protospacer sequence) Alternative to SgRNA In 3) _ three-component system: ۸ .هلاه 5 5 کم ‘SgRNA target-specitio guide sequence (Cas9-mediated DNA cleavage Host-mediated DNA repair mechansms: NHEJ HOR + artificial repair template ‘small insertion 5 ‏سل‎ 3 ‏اه‎ ee eee SET 13 ut 9 دا الا PE YT ‏امسو‎ rr 

صفحه 43:
مسیر ترمیمی اتصال انتهاهای غیر همولوگ (01۳170[-۳۳0 06و010صم1-ص۱۲0 ((NHEJ) Double Stranded Break Es ‏سح‎ ‏تسد‎ ‎1 Repair by ۱۱۷۴ TT 1 ‏اعهما‎ InDel Premature Frameshift Stop Codon mRNA a, شکل 3 مکالیسم سیر ترمیمی اتصال انتهامای غیر همولوگ ‎(Non-Homologous End-‏ (111۳7) 701088 به منظور اتصال انتهامای نلشی از 12818 یه همدیکر بدون استفاده از الکوی ممولوگ ۳/۸( می باشد. این فرآیند خطادار بوده و حذف يا اشاقه شدن تعداد کمی وکللوتید در این فرآیند اجتناب ناپذیر است. در نتیجه 1۳7۳۳( موجب ایجاد موتلسیون حذف یا اضاقه (8[ع(1) شده که می توالد لگوی خواش را تغییر داده یا موجب ایجاد کدون ختم در درون ژن شود. 

صفحه 44:
مشير ترفيك شباقتى تتدمرءع 1 0ع016ع21آ10037-1مدده1 Specific ‘Change HDR Repair Left Homology Arm | Right Homology Arm ‏شكل 41. در حضور الكوى ترميمى منلسب با‎ Template = X X ‏داشتن بازوهاى همولوك مستقيما بالادست و‎ DPN ‏شكسته ة ل‎ cl aed 8 mt ‏پایین دست 1۸ دورشته ای شکسته شده‎ x ‏لوت اساس مکالیسم ترمیمی شمافت‎ as9-induced Double eee tt ‏وتركيبي نر لساب‎ 1 Stranded Break nis oe ‏أتفاق مى اقتد. بنابرلين تغييرات دقيق مانند‎ حذف و اضافه در هر نقطه ای از ژئوم ‎OM‏ ست ‎Specific Change Introduced ۳۹‏ ‎To Genomic DNA by HDR:‏ mRNA 

صفحه 45:
KEY INDUSTRY APPLICATIONS Genome editing with CRISPR is simple, fast & scalable. Animal Models WwwAnebi.nim.nih ۴۷ 

صفحه 46:
هازانواع مختلف سيستم هاى مبتنى بر كريسير 1- مهندسی ژنوم به منظور تولید حیوانات ترانسژنیک و مدل جهت مطلعات بیولوژیک 2- فعلسازی و مهار بیان ژنهای هدف در سلول جهت مطالعات بیان ژن 3 اصلاح ژن های مسبب بیماری (ژن درمانی) 4 شناسیی تارگت های دارویی جدید 5- استفاده در مطالعات طراحی ‎sob‏ The FUTURE of “= a, 2 ‎Editing‏ قلاط ‎ ‎ 

صفحه 47:
sare) malaria cases & 429,000 deaths. گروهی از دانشمندان با استفاده از لین روش موفق به اصلاح و مهندسی ژنتیکی جلبک‌ها شدند. در نتیجه‌ی لين عملء.تا دو برابر بيشتر سوخت‌های زیستی بر پایه‌ی جلبک به دست مىآيد. انتشار اری‌های منتقل‌شده از پشمبه انسان مثل زیکایا مالاریا ابا استفاده از تکنیک ویرلیش ژن ۱5۴6/6۵59 محدود شد. در لین روش دانشمندان با استفاده از کربسپر. موفق به شکافت ژن‌های باروری پشه و تغییر چندین رمز ژنتیکی به‌طور هم‌زمان شدند. 2 alternative to fossil tera eee 00 rich oil 

صفحه 48:
محققین با بهره‌گیری از کریسپر موفق ببه از بين بردن شدند. در لین روش به‌نوعی قدرتمند شدند که باکتری‌های مقاوم را مجبوربه از بین بردن خود می‌کنند-با تجهیز ویروس‌های میکروفاژ به توللی ژنتیکی که شامل ژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک است. دانشمندان نوعی مکانیزم خود تخریبی را در باکتری‌ها ایجاد کردند. 

صفحه 49:
900 ‏مپچراء ۱000) سود مسولص مروت مموممساص ول‎ Por adeptue kext ta bacterts, Cesk Oedte, ate. vl. | PODS, Orpewber ۶ COME, 00۷ 109, ‏.مم‎ ۵8628۰ 5 Phe OR IGP Re chtcbxee cad tole to deopky ORTOP Re xed to cera detouares oP spacers und repeat. Orewa, |, BOOP, Ook. ©, p. (PE. : 000 ‏هس0۵‎ Dey € ‎Oller cad Prurcel, Okeke.‏ ,لعمم0) ,مسا ‎Peo, Ora, Yor cad Bw, Xoo.‏ مسار #بمصاسات لحت مامتا ‎geen mdicr! prowrese,‏ و 00۲۵۵0۵/۵9 5 ‎Abu Ovkvbor Oreos, Darck I, COUP, Oo. C9. ‎ ‎4G,» ‏۰ج‎ ۵ Bald P PS ORICPR-Doovcrted (Oc) Protea Pacokes exad Diliclke 0091000: 7 © ‏سروس‎ @xtot ir ‎Probarnte Bras. Wt, Datel WD, ot d. ‎ ‎or ‎ ‎ ‎ 

صفحه 50: