HLPCکروماتوگرافی

صفحه 1:
fi / بسم الله الرحمن ا حیم 

صفحه 2:
HLPC High Performance Liquid Chromatography 

صفحه 3:
مقدمه * در سال ۱۹۰۶ دانشمند روسیسبه نام تسوت گزارشی مبنی بر جداسازی اجزای رنگی موجود در عصاره برگهای گیلهی را با عبور دادن آن از ستونی که حاوی کربنات کلسیم و آلومینا و سوکروس بود ارائه داد. بر همین اساس او ولیه کروماتوگرافی را انتخاب نمود که از لغات بونانی می باشد: * کروم یعنی رنگ و گرافی بعنی نوشتن. 

صفحه 4:
* + * انواع کروماتوگرافی کروماتوگرافی ستونی ‎Column Chromatography‏ کروماتوگرافی مایع /جامد ‎Liquid Solid Chromatography‏ کروماتو گرافی مایع /مایع ‎Liquid Liquid Chromatography‏ کروماتو گرافی تعویض بون ‎Ion Exchange Chromatography‏ كروماتوكرافى زوج بون ‎Ion Pair Chromatography‏ Size Exclusion or Gel Chromatography ‏کروماتوگرافی نوع ژل‎ 

صفحه 5:
تاریخچه 11۳1.0 * پیش از دهه ۱۹۷۰ روشهای بسیار کم و غیر قا اعتمادی جهت کروماتو کرافی در لابراتوار ۵ وجلاد داشت. توسعه کروماتوگرافی ملیع با فشار بالا در اواسط دهه ۱۹۷۰ انجام شد. در اواخر دهة ۱۹۷۰ روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی ملیح با فاز معکوس لین امكان را فر آهم كرشتا جداسازى تركيبات بسيار مشابه» عملى كردد. * در دهة ‎198٠‏ به طور رایج تری از 111.200 براى جداسازی» خالص سازی مواد استفاده شد | 

صفحه 6:
دستگاه :۲۱۳1 دستگاه های ۲11.0 از نظر ساختمانی و قابلیتهای مختلف‌با یکدیگر متفاوت هستند ولی از نظر اصول کاربااهم مشترک‌می باشنسیک دستگام 21.0 معمولا تشکیل شده از : یک / دو / سه /جا چهار بطری مخصوص فازهای متحرک (مخاژن معلول) <دستگاه الکترونیکی <دستگاه تزریق کننده (۲660101) پمپ يا موتور <حلقه نگه دارنده نمونه تزریق شده با حجم مشخص <جایگاه نصب ستون <دستگاه آشکار ساز ( 1017© 1(©6186) <دستگاه جمع آوری فراسیون های جداشده <ظرف ظایعات <دستگاه ثست ننایج یا کامپیوتر و جهت کنترل کلید سیستم ‎(Recorder)‏ 

صفحه 7:
نامهای سیستمهای ).۲1۳1 بر حسب تعداد حلال ها <اگر دستگاه 111.6 شامل یک پمپ و یک بطری حلال باشد 0 150 <اگر دستگاه 6 شامل دو پمپ و دوبطری حلال باشد ‎Gradient Binary Pumps‏ >51 دستگاه ‎ols HPLC‏ سه پمپ و سه بطری حلال باشد ‎Gradient Ternary Pumps‏ < اگر دستگاه 11۳1.6 شامل چهار پمپ و چهار بطری حلال باشد ‎Gradient‏ 

صفحه 8:
07۲ ميجه تجلي حلااها 4 H,O > Ethanol > n-propanol > Acetone > Ethyl acetate > Ethyl ether > Chloroform > Dichloromethane > Toluene > Tricholoroethane > Cyclohexane > Petroleum > ether ... 

صفحه 9:


صفحه 10:
پمپ های 11.۳6با سرعتهای جریانهای مختلف عبارتند 3! * بمب هابى با مكش 0/001 ‎ML 0/1 Micro HLPC GML‏ "* پمپ هایی با مکش ۷۲],0/01۱ تا ۴۲:۳0 ۷۲۵0۲۵0 ۱ ,1۷۲۲ * يبمب هابى با مكش 0/01 ‎ML 9/9 Analytical HLPC GML‏ ML 10 Semiprepraative GML3 ‏يبمب هابى با مكش‎ * HPLC * پمپ هایی با مکش ۷۲۲,10 تا ۳۳۵0۳۵۵13۷6۵ ‎HPLC‏ 1211.50 

صفحه 11:
ستون هاى 111.120 * ستون های ‎HPLC‏ برای نوع کرموتوگرافی عبارتند از : * كروماتوكرافى ‎ORPTION / ADSORPTION‏ * ستون های فاز زمان هستند که محتوای آسن ها پودر ۸ تبه طور خاص‌حی باشند. از لحاظ شیمیلیی قطبی بوده‌چس فاز متحرک ‎ol‏ حی بابست غیر قطبی باشد. این ستون‌ها برای جداسازی مواد آلی قطبی استفاده می شود از جمله فاز متحرک لین گونه ستون ها: هگزان» هپتان» بوتانول» متانول» ... مقدار بسیار جزئی آب می باشد. 

صفحه 12:
PARTITION (51,5 silog 5 + ستون های فاز 1317۳12517 هستند که محتوای تن ها علاوه بر 511.10۸ بر روی آّن هیدروکربورهاییدر می باشد در نتيجه محتوای ستون ها دارای خواص غیر تجلی عی گردد. فاز متحرک لین ستون ها: متانول » استونیتریل» سبا فرم های فسفات ولّب و ... می باشند. لین ستون ها برای جداسازی مواد غیر قطبی استفاده می شوند. 

صفحه 13:
کروماتوگرافی بونی بونی * ستون های تعویض بون شامل رزنی ۳0157686 1 مسمسمی باشد که قابلیت دربلفت بنیان های اسید و بازی شدن را دارد کروماتوگرافی نوع ژل * شلمل ستون هلیی‌که محتواي آّن ها پلیمرهای زنجیره ای به هم پیوسته ‎Polyacyelamide‏ با ۳۵۱0۵۲۵0۳01۲۵6 می باشد. این ستون ها برای جدا سازی پروتئین هاء اسبد های آمینه» آنزیم‌هاء پپتیدهاء اسیدهای نو کلوئیک و ... استفاده می گردند. 

صفحه 14:
‎CHIRAL bh yy 9‏ / ستون هلیی هستند که محتوى كن ها شامل ‎cyclodextrine 4 amylase‏ 9 / 6 مصی باشند که برای جدا سازی مولوکول هلیی با شکل فضایی ‎Enantiomers‏ و 5 سستند به کار می ‏روند. ‎ 

صفحه 15:
آشکار سازها ‎Detectors‏ 1 5 و ‎oye Photo Diode Array‏ کلربرد را ولو دیلبیو شناسلییغامبمواد دلرند thea lad Of pet pet cuit soles Fluorescence ۰ دار از قببلویتلمین136» آنزیمها یلسیدهای‌لمینه بسکار رود. . 116122101211 بيلواندليه كير وتغيبياتشييب شسکستمواد نسسبتسه فاز متح رکبه کار عی ود. Amprometer / Electro chemical / . ‎Coductivity Ion‏ بيشترينردبابها در اندليه كيروبونها بكار كرفته موشوذله ‎ 

صفحه 16:
۸ 2011 ابا ‎Computer‏ دستگاه های فوق چس از شناسایی مولوکول ها توسط دتکتور امواجی را لحظه به لحظه از طریق دستگاه تبدیل به نام 1۳0161]206 دریلفت کرده و سپسبه صورت منحنی بر روی کاغذ رسم و یا روی مانیتور نمایش می دهند. 

صفحه 17:
Fraction Collector مواد جدا شده از ستون از لحظه آشکار شدن منحنیستا لحظه پایان منحنی‌به جای لین که وارد ظرف ظایعات شوذ وارد دستگاه فوق شده و اوپراتور دستگاه با دادن" اطلاعات از قبیل زمان لحظه شروع پیک مورد نظر تا زمان پایان همان پیک - حجم جمع آوری نمینه ها در لیله های آزمایشی را وبه همین تریب برای سایر پیک های دیگرمبه دستگاه تعییف و قادر خولهد بود نمونه های مورد نظر را استخراج کند. لین وضعیت بیشتر در دستگاه های ‎Semi -, Preparative HPLC‏ ‎Preparative‏ » کار گرفته می شوند. 

صفحه 18:
Auto sampler changer دستگاه خودکاری است که کاربر با دادن اطلاعات از قبیل حجم تزریق» زمان تزییق» تعداد دفعات تزربق» موضوع گذاری و یال های حاوی نمونه های تحت تزییق - و حجم شستشو سرنگ به دستگاه فوق کلیه اعمال به طور اتوماتیک صورت می پذیرد. 

صفحه 19:
مزایای ۲1۳۲.67 کروماتو گرافی کاربرد 11۳1.0 براى مواد غير فرار به // قرار زير مى باشد: تا از ستونهای طوالنی که سرعت محلول در تمام طول ّن ها نزدیک به مطلوب / تیین سرعت‌سی بلشدمی توان استفاده کرد و امکان تغییر دادن ماهین فاز متحرک برای انجام شستشوی تدریجی و شستشوی مرحله اییا هر دو وجود دارد. 

صفحه 20:
موارد استفاده از ‎HPLC‏ جداسازى» خاص سازی و شناسایی پروتئینها ۴ و ترکیبات آلی‌به ویژه ترکیبات دارویی. همچنین در برخی از آزملیش های مربوط به تعیین غلظت داروها. / در تحقیقات پروتومیک. (آنالیز و هضم پروتئین) تعیین ساختار پلیمر مقایسه ساختارهای پلیمرهای مختلف 

صفحه 21:
کار با دستگاه * فاز متعرک راجا خلوص ۲1۳1.0 تهیه و فیلتر کرده» آن را در بطری ریخته. ستون مناسب را نصب و دتکتور را روشن کرده طول موج خاص را تنطیم و دستگاه کامپیوتر را روشن کرده. سپس طبق روش سرعت جریان فاز متحرک را تنظیم و دستگاه را به مدت ۳۰ للی ۴۵ دقیقه در حللت جریان و بدون تزریق قرار داده قلبه تعادل رسد. ضمنا وجودهر کهنمنا خالصی در اجرای تشکیل دهنده فاز متحرک باعث نا پابداری در خط پلیه و به تعادل نرسیدن فار متحرک در ستون می بایست مجدداً آن را تهیه نمود. 

صفحه 22:
چس از ۴۵ دقيقه جذب فاز متحرک صفر کرده ابتدا محلول آزمایش صحت کار دستگاه را تزییق کرده. در لین بررسی فاکتور تفکیک‌سا بين بيك ها و دم بيك هاء تعداد صفحات فرضی ستون برای اندازه گیر: ماده آزملیش و فاکتور ظرفیت محاسبه حی گردند. آزملیش موق معتبر است که نتلیچبه دست آمده در محدوده شروط داده شده باشد. بعد از لین مرحله محلول استاندارد را حدلقل ۵ بارجه دستگاه تزریق کرده و میزان انحراف استاندارد رابه دست آورده و لین رقم می بایست از حد مجاز کمتر باشد..چس از لین قسمت نمینه آزمایش را حدلقل ۳ بار تزییق کرده و در آخر مجدداً محلول استاندارد تزریق عی شود. میانگین نتلیج مساحت های منحنی های استانداردها مقایسه و مقدار ماده موْثر را بر حسب غلظت و با درصد محاسبه کرده. 

صفحه 23:
روش های اندازه گیری :Normalization * ۵ ‎f‏ یعنی فقط بثت و اندازه گیری درصد پیک های مورد نظر در كروماتوكرامبه جز بيك های مربوطبه حلال ها و پیک های موربوطبه مزاحمت های زمینی روی خط پلیه انجام گیرد. بیشتر برای اندازه گیری مواد جانبی صورت می گیرد. ‎ 

صفحه 24:
روش های اندازه گیری :External Std * اندازه گیری ماده میْثر در مقلبل رفرنس استاندارد همان ماده مورد آزمایش . 

صفحه 25:
:Internal Std اندازه گیری ماده موّثُر در مقابل رفینس استاندارد همان ماده مورد آزمایش در كنار ماده دوم كه از لحاظ ساختمان مولكيلى شبلهسببه ماده مؤثر داث ولى نبليد هيجكاه در جداسازىببا ماده مؤْثْر وساير مواد جلفبى ديكر تداخل نمايد. ماده 51601 11216171121 با غلظت مشخص و معين تهيه شده وصبه كليه نمینه های آزمایشی و رفینس استاندارد شیک میزان ربخته شده و دارای غلظت ثلبت در تملمی نمینه ها و استاندارهاعی باشد. نتيجه اينكه هر كونه انحراف در سطح زیر منحنی استاندراد به وجود آید به همان اندازه در سطح ير منحنى نمونمبه وجودد.حهى آيدسبا استفاده از روش 510 1128617221 کلیه خطاها پوشش داده‌حی شود و از دقت اندازه گیری بالاتری برخوردار است. 

صفحه 26:
Retention Time (min) (ny) eoueqosay 

صفحه 27:
50 55 60 96 40 45 Retention Time (min) 30 20 26 15 ‘Absorbance (AU) 

بسم اهلل الرحمن الرحیم مقدمه در سال 1906دانشمند روسی به نام تسوت گزارشی مبنی بر جداسازی اجزای رنگی موجود در عصاره برگهای گیاهی را با عبور دادن آ ن از س تونی که حاوی کربنات کلسیم و آلومینا و سوکروس بود ارائه داد. بر همین اس اس او واژ ه کروماتوگرافی را انتخاب نمود که از لغات یونانی می باشد: کروم یعنی رنگ و گرافی یعنی نوشتن. انواع کروماتوگرافی Column Chromatography کروماتوگرافی ستونی  Liquid Solid Chromatography جامد/کروماتوگرافی مایع  Liquid Liquid Chromatography مایع/کروماتوگرافی مایع  Ion Exchange Chromatography کروماتوگرافی تعویض یون  کروماتوگرافی زوج یون  کروماتوگرافی نوع ژل  Ion Pair Chromatography Size Exclusion or Gel Chromatography تاریخچه HPLC پی ش از ده ه 1970روشهای بس یار ک م و غی ر قابل اعتمادی جه ت کروماتوگرافی در البراتوار 5وجود داشت .توس عه کروماتوگراف ی مای ع با فشار باال در اواس ط ده ۀ 1970انجام شد .در اواخ ر دهۀ 1970 روشهای جدیدی شام ل کروماتوگراف ی مای ع با فاز معکوس این امکان را فرآهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه ،عملی گردد. در ده ۀ 1980ب ه طور رایج تری از HLPCبرای جداسازی ،خالص سازی مواد استفاده شد دستگاه HPLC دس تگاه های HPLCاز نظ ر س اختمانی و قابلیتهای مختل ف ب ا یکدیگر متفاوت هستند ولی از نظر اصول کار با هم مشترک می باشند یک دستگاه HPLCمعموال تشکیل شده از : ی ک /دو /س ه /ی ا چهار بطری مخصوص فازهای متحرک (مخازن محلول) ‏دستگاه الکترونیکی ‏دستگاه تزریق کننده ()Injector ‏پمپ یا موتور ‏حلقه نگه دارنده نمونه تزریق شده با حجم مشخص ‏جایگاه نصب ستون ‏دستگاه آشکار ساز ()Detector ‏دستگاه جمع آوری فرامسیون های جداشده ‏ظرف ظایعات ‏دس تگاه ثب ت نتای ج ی ا کامپیوت ر و جه ت کنترل کلی د سیستم ()Recorder نامهای سیستمهای HPLCبر حسب تعداد حالل ها اگر دستگاه HPLCشامل یک پمپ و یک بطری حالل باشد ‏ISO CRATIC اگر دستگاه HPLCشامل دو پمپ و دوبطری حالل باشد ‏Gradient Binary Pumps اگر دستگاه HPLCشامل سه پمپ و سه بطری حالل باشد ‏Gradient Ternary Pumps اگر دستگاه HPLCشامل چهار پمپ و چهار بطری حالل باشد ‏Gradient  درجه ت جلیتحال لهاSOLVENT H2O > Ethanol > n-propanol > Acetone > Ethyl acetate > Ethyl ether > Chloroform > Dichloromethane > Toluene > Tricholoroethane > Cyclohexane > Petroleum > ether … پم پ های HLPCبا س رعتهای جریانهای مختل ف عبارتند از: ‏ پمپ هایی با مکش ML 0/001تا ML 0/1 Micro HLPC ‏ پمپ هایی با مکش ML 0/01تا ML 1 Macro HLPC ‏ پمپ هایی با مکش ML 0/01تا ML 9/9 Analytical HLPC ‏ پمپ هایی با مکش ML 3تا ML 10 Semiprepraative ‏HPLC ‏ پمپ هایی با مکش ML 10تا ML 50 HPLC Prepraative ستون های HLPC ستون های HPLCبرای نوع کرموتوگرافی عبارتند از : کروماتوگرافی SORPTION / ADSORPTION س تون های فاز زمان هس تند ک ه محتوای آ ن ها پودر SILICAبه طور خاص می باشند .از لحاظ شیمیایی قطبی بوده پ س فاز متحرک آ ن م ی بایس ت غی ر قطب ی باشد .این ستون ها برای جداسازی مواد آلی قطبی استفاده می شود از جمله فاز متحرک این گونه ستون ها :هگزان ،هپتان ،بوتانول، متانول ... ،مقدار بسیار جزئی آب می باشد. کروماتوگرافی PARTITION ستون های فاز REVERSEهستند که محتوای آن ها عالوه بر SILICAبر روی آ ن هیدروکربورهاییدر می باشد در نتیجه محتوای ستون ها دارای خواص غیر تجلی می گردد .فاز متحرک این ستون ها :متانول ،استونیتریل، با فرم های فسفات و آب و ...می باشند .این ستون ها برای جداسازی مواد غیر قطبی استفاده می شوند. کروماتوگرافی یونی یونی س تون های تعوی ض یون شام ل رزنی Polystyrene divinglمی باشد که قابلیت دریافت بنیان های اسیدی و بازی شدن را دارد کروماتوگرافی نوع ژل شامل ستون هایی که محتوای آن ها پلیمرهای زنجیره ای ب ه ه م پیوس ته Polyacyelamideیا Polycarbohydratesمی باشد .این ستون ها برای جدا سازی پروتئین ها ،اسید های آمینه ،آنزیم ها ،پپتیدها، اسیدهای نوکلوئیک و ...استفاده می گردند. ستون های CHIRAL ستون هایی هستند که محتوی آن ها شامل amylaseو cyclodextrineو celluloseم ی باشن د که برای جدا س ازی مولوکول های ی ب ا شک ل فضایی ‏Enantiomers و Diasterimoresهس تند ب ه کار می روند. آشکار سازها Detectors .1 UV/VISو Photo Diode Arrayب یشترین اغلب واد دارند ک اربرد را ب رایرد یابیو ش ناسایی م .2 یابی رخیم واد ف لورسانس Fluorescenceب رایرد ب دار از ق بیلویتامین ، B6آنزیمها و اسیدهایآمینه ب کار م ی رود. .3 یری غییراتض ریب ت Refractometerب رایاندازه گ تحرک ه ک ار م یرود. ب سبت ه ف از م ب ش کستم واد ن .4 ‏Amprometer / Electro chemical / Coductivity Ionب یشتری نرد یابها در اندازه یری ونها ب کار گ رفته م یش وند. ی گ Integrator ‏Computer و ی ا دس تگاه های فوق پ س از شناس ایی مولوکول ها توس ط دتکتور امواج ی را لحظ ه ب ه لحظه از طری ق دس تگاه تبدی ل به نام Interface دریافت کرده و سپس به صورت منحنی بر روی کاغذ رسم و یا روی مانیتور نمایش می دهند. Fraction Collector مواد جدا شده از ستون از لحظه آشکار شدن منحنی تا لحظه پایان منحن ی ب ه جای ای ن ک ه وارد ظرف ظایعات شوند وارد دس تگاه فوق شده و اوپراتور دس تگاه با دادن اطالعات از قبی ل زمان لحظ ه شروع پی ک مورد نظ ر تا زمان پایان همان پیک -حجم جمع آوری نمونه ها در لوله های آزمایشی را و به همین تریب برای سایر پیک های دیگر به دستگاه تعریف و قادر خواهد بود نمونه های مورد نظر را استخراج کند .این وضعیت بیشتر در دستگاه های Preparative HPLCو– Semi Preparativeبه کار گرفته می شوند. sampler ‏changer ‏Auto دستگاه خودکاری است که کاربر با دادن اطالعات از قبیل حجم تزریق ،زمان تزریق ،تعداد دفعات تزریق ،موضوع گذاری و یال های حاوی نمونه های تحت تزریق – و حجم شستشو ُسرنگ ب ه دس تگاه فوق کلی ه اعمال به طور اتوماتیک صورت می پذیرد. مزایای HPLCکروماتوگرافی کاربرد HPLCبرای مواد غی ر فرار به قرار زیر می باشد: ‏ از ستونهای طوالنی که سرعت محلول در تمام طول آن ها نزدیک به مطلوب ترین سرعت می باشد می توان استفاده کرد و امکان تغیی ر دادن ماهین فاز متحرک برای انجام شستشوی تدریجی و شستشوی مرحله ای یا هر دو وجود دارد. موارد استفاده از HPLC ‏ جداسازی ،خاص سازی و شناسایی پروتئینها و ترکیبات آل ی ب ه ویژه ترکیبات دارویی. همچنین در برخی از آزمایش های مربوط به تعیین غلظت داروها. ‏ در تحقیقات پروتومیک( .آنالی ز و هضم پروتئین) ‏ تعیین ساختار پلیمر ‏ مقایسه ساختارهای پلیمرهای مختلف کار با دستگاه ‏ فاز متحرک را با خلوص HPLCتهیه و فیلتر کرده ،آن را در بطری ریخته .س تون مناس ب را نص ب و دتکتور را روشن کرده و طول موج خاص را تنطیم و دستگاه کامپیوتر را روشن کرده .سپس طب ق روش س رعت جریان فاز متحرک را تنظی م و دس تگاه را به مدت 30الی 45دقیقه در حالت جریان و بدون تزریق قرار داده تا به تعادل رسد .ضمن ًا وجود هر گونه نا خالصی در اجرای تشکیل دهنده فاز متحرک باع ث ن ا پایداری در خ ط پای ه و به تعادل نرسیدن فار متحرک در ستون می بایست مجدد ًا آن را تهیه نمود.  پ س از 45دقیق ه جذب فاز متحرک ص فر کرده ابتدا محلول آزمایش صحت کار دستگاه را تزریق کرده .در این بررسی فاکتور تفکیک ما بین پیک ها و دم پیک ها ،تعداد صفحات فرضی ستون برای اندازه گیری ماده آزمای ش و فاکتور ظرفی ت محاس به م ی گردند .آزمای ش موقعی معتبر است که نتایج به دست آمده در محدوده شروط داده شده باشد. بعد از این مرحله محلول استاندارد را حداقل 5بار به دستگاه تزریق کرده و میزان انحراف اس تاندارد را ب ه دس ت آورده و ای ن رق م می بایس ت از ح د مجاز کمت ر باشد .پ س از این قس مت نمون ه آزمایش را حداقل 3بار تزریق کرده و در آخر مجدد ًا محلول استاندارد تزریق می شود .میانگین نتایج مساحت های منحنی های استانداردها مقایسه و مقدار ماده مؤثر را بر حسب غلظت و یا درصد محاسبه کرده. روش های اندازه گیری : Normalization  یعنی فقط بثت و اندازه گیری درصد پیک های مورد نظر در کروماتوگرام به جز پیک های مربوط به حالل ها و پیک های موربوط به مزاحمت های زمینی روی خط پایه انجام گیرد .بیشتر برای اندازه گیری مواد جانبی صورت می گیرد. روش های اندازه گیری : External Std  اندازه گیری ماده مؤث ر در مقاب ل رفرن س استاندارد همان ماده مورد آزمایش . : Internal Std ‏ اندازه گیری ماده مؤثر در مقابل رفرنس استاندارد همان ماده مورد آزمایش در کنار ماده دوم که از لحاظ ساختمان مولکولی شباهت به ماده مؤثر داشته ولی نباید هیچگاه در جداسازی با ماده مؤثر و سایر مواد جانبی دیگر تداخل نماید .ماده Internal Stdبا غلظت مشخص و معین تهیه شده و به کلیه نمونه های آزمایشی و رفرنس استاندارد 5یک میزان ریخته شده و دارای غلظت ثابت در تمامی نمونه ها و استاندارها می باشد .نتیجه اینکه هر گونه انحراف در سطح زیر منحنی استاندراد به وجود آید به همان اندازه در سطح زیر منحنی نمونه به وجود می آید .با استفاده از روش Internal Std کلیه خطاها پوشش داده می شود و از دقت اندازه گیری باالتری برخوردار است.