آزمایشگاه میکروبیولوژی غذایی

آزمایشگاه میکروبیولوژی غذایی

اسلاید 1: بسم الله الرحمن الرحیمنام درس : آزمایشگاه میکروبیولوژی غذایی1

اسلاید 2: پارت 1 : تست های تشخیصی استافیلوکوک ها2

اسلاید 3: تست های افتراقی استافیلوکوک هاتست کوآگولازتست کاتالازتست DNaseتست مانیتول سالت آگارتست حساسیت به باسیتراسین و نووبیوسین3

اسلاید 4: مقدمه ای بر استافیلوکوک هااستافیلوکوک ها کوکسی های گرم مثبت به قطر ۵/۰ تا ۵/۱ میکرومتر متعلق به خانواده میکروکوکاسه می باشند، که معمولا بطور نامنظم و خوشه انگور رشد می کنند، مخصوصا زمانیکه در محیط مایع کشت داده شوند.استافیلوکوک ها فاقد حرکت و بدون اسپور می باشند، آنها قادرند در محیط کشت نوترینت آگار حاوی ۵ درصد نمک رشد کند . تست کاتالاز مثبت و اکسیداز منفی می باشد. اکثر گونه ها نیترات را به نیتریت احیاء می کنند. دمای بهینه برای رشد آنها ۳۷ درجه سانتیگراد است. از میان گونه های متعدد این جنس سه گونه از همه شایعتر و مهمتر است عبارتند از: استافیلوکوکوس اورئوس، استافیلوکوکوس اپیدرمیس و استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس. استافیلوکوک ها روی محیط های کشت جامد پیگمانهای طلایی ، لیمویی و سفید ایجاد میکنند .تولید پیگمان به شرایط محیط بستگی دارد . بطور مثال در مجاورت هوا ، حرارت 22 درجه سانتیگراد ، وجود شیر در محیط کشت ، پیگمان بهتر تشکیل میشود .در سطح پوست، دهان و دستگاه تنفس فوقانی انسان بصورت فلور طبیعی حضور داشته، همچنین در مواردی پاتوژن انسانی محسوب می گردد. استافیلوکوکوس اورئوس مهمترین گونه بیماریزا است و امکان جداسازی آن از پوست و مخاط وجود دارد. کلنی این باکتری در محیط نوترینت آگار یا آگار خونی به اندازه ۱ تا ۳ میلیمتر کدر و به رنگ زرد طلایی می باشد. این باکتری مقاوم به نمک بوده و در محیط های حاوی ۱۰ درصد نمک طعام رشد می کند و دارای ۴ ویژگی متمایز زیر است:همیشه آنزیم کواگولاز تولید می کند.قدرت تخمیر مانیتول را داشته و ایجاد اسید می نماید.در محیط آگار خونی همولیز بتا ایجاد می کند( به دلیل وجود آلفاتوکسین).ایجاد رنگدانه زرد طلایی می نماید.4

اسلاید 5: تست کوآگولاز و اساس و کنترل کیفی آنیکی از تست‌های قابل اعتماد در شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس می‌باشد که به دو روش لوله‌ای یا اسلایدی قابل اجرا است. کوآگولاز استافیلوکوکی یک پروتئین با ترکیبات ناشناخته می‌باشد که فعالیت مشابه پروترومبین داشته که فیبرینوژن را به فیبرین تبدیل می‌کند و لخته ایجاد می‌شود. برای انجام تست کواگولاز از پلاسمای خرگوش یا انسان که با EDTA تهیه شده (بصورت لیوفیلیزه قابل دسترسی می‌باشد) استفاده می‌شود. می‌توان از خون تاریخ گذشته بانک خون و پلاسمای فریز شده تا دو هفته برای انجام آزمایش استفاده کرد. باید توجه داشت که در پلاسمای سیتراته بعضاً واکنش مثبت کاذب توسط برخی باکتری‌ها از جمله استرپتوکوک فکالیس ایجاد می‌شود. بیش از ۹۵٪ از جدایه‌های S. aureus تست اسلایدی کواگولاز مثبت هستند که clumping factor را شناسایی می‌کنند و تقریباً در ۱۰۰٪ جدایه‌ها تست لوله‌ای کوآگولاز مثبت می‌ شود. تست اسلایدی کواگولاز در استافیلوکوکوسلگدنسیس، استافیلوکوکوس شلفری مثبت است. در هر آزمون اسلاید باید یک کنترل از امولسیون کلنی‌های مشکوک در نمک استفاده شود تا اطمینان حاصل گردد که autoagglutination رخ نداده است. اگر اتوآگلوتیناسیون رخ داد، نتایج آزمون اسلاید برای تعیین ماهیت کواگولاز طبیعی در ایزوله‌ها نامناسب است.برای کنترل کیفی تست باید از سوش‌های استاندارد استافیلوکوکوس اورئوس (کنترل مثبت) و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (کنترل منفی) استفاده کرد.5

اسلاید 6: مراحل تست کوآگولاز این تست به دو روش انجام میشود : روش لوله و روی لام استاف های کواگولاز مثبت مانند اورئوس قادر به تولید آنزیم کواگولاز و برخی پروتئین های دیگر با خاصیت انعقادی می باشند. این فاکتورها قادرند پروترومبین را بدون نیاز به کلسیم به ترومبین تبدیل  نموده و پلاسما را منعقد کنندروش لوله :ابتدا پلاسمای سیتراته (حاوی ضد انعقاد سیترات) خرگوش یا انسان را به نسبت 1 به 5 رقیق کنید.برای رقیق کردن میتوانید از سرم فیزیولوژی استفاده کنید.(1 پلاسما و 5 سرم فیزیولوژی)…سپس از این پلاسمای رقیق شده مقدار 0.5 سی سی را درون یک لوله بریزید.حال مقدار کمی از کلنی استافیلوکوک را با پلاسمای درون لوله خوب مخلوط کنید.لوله را 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه قرار دهید.اگر مشاهده کردید پلاسما لخته شد، باکتری کواگولاز مثبت است و اگر لخته مشاهده نکردید میبایست 24 ساعت لوله را در انکوباتور 37 درجه قرار دهید و سپس وجود لخته را بررسی نمایید…روش لام:ابتدا یک لام تمیز را روی سطح قرار دهید.یک قطره سرم فیزیولوژی روی آن بریزید.حال مقداری کلنی استافیلوکوک را با این سرم ف مخلوط کنید.سپس یک قطره پلاسمای رقیق شده را به آن بیفزایید و مرتب هم بزنید.اگر استافیلوکوک کواگولاز مثبت باشد در عرض 10 ثانیه آگلوتیناسیون به صورت ذرات توده مانند روی لام مشاهده خواهد شد.6

اسلاید 7: تست کاتالاز  در رنجیره ی انتقال الکترون که در غشای سیتوپلاسمی باکتری ها قرار دارند،آنزیم سیتوکروم اکسیداز وجود دارد.سیتوکروم اکسیداز آنزیمی تنفسی است و هیدروژن و اکسیژن راترکیب کرده و مولکول آب ایجاد می کند.در متابولیسم باکتری های هوازی،همیشه آب تولید نمی شود و در بعضی موارد سوپر اکسید یا رادیکال آزاد اکسیژن تولید می شود که یون فوق العاده فعالی است و با مولکول های داخل سلولی واکنش داده و به آنها آسیب می رساند.آنزيم كاتالاز باعث تجزيه پراكسيد هيدروژن به آب و اكسيژن مي‌گردد. پراكسيد هيدروژن  يك محصول متابوليك سمي براي باكتريهاست. تمام اعضاء خانواده استافيلوكوك كاتالاز –  مثبت هستند، در صورتي كه اعضاء جنس استرپتوكوك كاتالاز – منفي مي‌باشند. همچنين آزمايش كاتالاز مي‌تواند ليستريا منوسيتوژن (كاتالاز – مثبت) را از استرپتوكوك بتاهموليتيك  متمايز كند. بيشتر گونه‌هاي نايسريا كاتالاز – مثبت هستند. همچنين از آزمايش كاتالاز  مي‌توان جهت تمايز بين گونه‌هاي باسيلوس (كاتالاز – مثبت) از گونه‌هاي كلوستريديوم (اغلب كاتالاز – منفي) كمك گرفت. آزمايش كاتالاز را مي‌توان بر روي مقدار بسيار كمي از باكتريهاي رشد نموده بر روي سطح آگار انجام داد.7

اسلاید 8: 8