کشت سلول و بافت گیاهی

کشت سلول و بافت گیاهی

اسلاید 1: بِسْمِ اللَّهِ الرَّحْمَنِ الرَّحِيمِ

اسلاید 2: كشت سلول و بافت گياهي

اسلاید 3: وقتي درباره كشت گياه صحبت مي شود معمولاً منظور كشت گياهان در گلدان، زيرپلاستيك، گلخانه و يا مزرعه مي باشد.تكثير رويشي كه شامل قلمه زدن، خوابانيدن و پيوند زدن مي باشد از ديرباز در كشاورزي اهميت داشته واز آن در تكثير گياهان زراعي، درختان ميوه و ... استفاده مي شود. البته روشهاي تكثير رويشي در شرايط طبيعي در برخي موارد كارآمد نبوده و روش جديدي از كشت گياهان، تحت عنوان كشت سلول و بافت گياهي معرفي و ارائه شده است.كشت سلول و بافت گياهي كه با عنوان كشت درون شيشه( invitro) و يا كشت استريل نيز مطرح مي شود و در مورد تمام انواع كشت هاي استريل كه در شرايط درون شيشه اي انجام مي گيرد ، به كار مي رود.در حال حاضر تكنيكهاي كشت بافت به عنوان ابزاري قوي جهت مطالعه مشكلات اساسي و كاربردي بيولوژي گياهي در آمده است. علاوه برآن در سالهاي اخير اين تكنيك ها كاربردهاي تجاري گسترده اي درتكثير گياهان مختلف از جمله گياهان زينتي و دارويي و نيز حذف عوامل بيماريزا از گياهان پيدا نموده است.مقدمه1

اسلاید 4: مقدمهبيوتکنولوژي سلولي و مهندسي ژنتيک زمينه‎های اصلي بيوتکنولوژي نوين را تعيين کرده و شامل روش‏هايي مي‎باشند که در قرن بيستم به‎طور وسيع توسعه يافته و در بسياري از کشورها مورد استفاده قرار گرفته‎اند.بيوتکنولوژيعلمی مشتمل بر روش‏ها و تکنيک‏هاي توليد، ذخيره‏سازي و فرايندهاي کشاورزي و همچنين محصولات ديگري که مواد زيستي معمولي و غيرتراريخته گياهان، حيوانات و ريزسازواره‎ها را در شرايط طبيعي و مصنوعي به کار مي‎برند2

اسلاید 5: مقدمهبيوتکنولوژي سلولي بر ويژگي خاص سلول از قبيل خاصيت توتي‎پوتنسي سلول، توانايي باززايي يک موجود کامل از آن و همچنين قابليت سنتز متابوليت‏هاي ثانويه باارزش از اين سلول‏ها بنيان نهاده شده است و از اين طريق:توسعه سريع فرم‏ها و لاين‏هاي باارزش محصولات جديد را از طريق اصلاح به منظور ايجاد مقاومت به تنش‏هاي زنده و غيرزندهافرايش توليد و کيفيت محصولات کشاورزيريزازديادي ژنوتيپ‏هاي باارزشعاري‏سازي گياهان از ويروس‏ها و ويروئيدهادستيابي به مواد فعال بيولوژيکي جهت اهداف پزشکي و تغذيه‏اي3

اسلاید 6: كشت بافتکشت بافت چیست؟کشت بافت یکی از روش های مهندسی ژنتیک است که از راه آن یک سلول یا بافت از یکی از اندام های گیاهی را درون بستر مناسب و محیط کشت قرار می دهند تا در اثر تغذیه و رشد آن یک گیاه کامل حاصل آید.بافت در واقع مجموعه‌ ای از سلول‌ های اندام‌ های گیاهی را تشکیل می‌ دهد و البته به‌ طور کلی این کلمه برای همه موجودات زنده مورد استفاده قرار می‌ گیرد . بافتی که برای کشت انتخاب می‌ شود باید از هر گونه بیماری سالم باشد و در واقع بخشی باشد که لیاقت کامل شدن و تبدیل شدن به گیاه کامل را داشته باشد.4

اسلاید 7: كشت بافتچرا کشت بافت؟یکی از کاربردهای مهمی که باعث می‌ شود تکنیک کشت بافت مورد استفاده قرار گیرد ، تکثیر و ازدیاد گونه‌ های مقاوم و مفید هستند . جذابیتی که این روش از تکثیر دارد تبدیل یک گیاه کامل از بافتی کوچک است . بستر کشت در این روش محیطی سرشار از مواد غذایی است تا بتواند بافت مورد نظر را تا زمانی که بتواند گلیم خود را از آب بیرون بکشد ، تغذیه کند.فضای مورد استفاده برای کشت بافت ، محیطی بسته و راکد است و به‌ طور معمول از محفظه شیشه‌ ای یا پلاستیکی شفاف تشکیل می‌ شود تا بتواند نور را نیز تا اندازه مورد نیاز دریافت کند5

اسلاید 8: كشت بافتمزایای کشت بافت گیاهان :از مزایای کشت بافت تولید انبوه و سریع یک رقم مطلوب و یا رقم های جدید است . در گیاهان بذرهای تولید شده کاملا همانند گیاه مادر خود نیستند . همچنین این بذور با یکدیگر نیز تفاوت دارند . پس چنانچه یک گیاه مطلوب در منطقه ای توسط کشاورزان برگزیده شود و از آن بذر تهیه نمایند ، تضمینی وجود ندارد که بذور سبز شده ویژگی های مورد نظر را داشته باشند . همچنین از راه های معمول مانند قلمه زدن نیز نمی توان بسیاری از گیاهان را تکثیر کرد . اما با استفاده از روش های کشت بافت می توان در زمان کوتاه تعداد زیادی از یک گیاه مطلوب را تهیه نمود.*از مزایای کشت بافت تولید انبوه و سریع یک رقم مطلوب و یا رقم های جدید است . با استفاده از کشت بافت میتوان با روش هایی آلودگی ها بویژه ویروس را حذف نمود و از آن پس تمام گیاهان تولید شده عاری از آلودگی هستند.6

اسلاید 9: اولين بار در سال 1838 اشليدن و شوان تئوري را ارائه نمودند. براساس اين تئوري ، هر يك از سلولهاي يك موجود پرسلولي اگر در شرايط مطلوب محيطي قرار بگيرند توانائي تكامل و تبديل شدنبه يك موجود كامل را دارند. بعدها اين تئوري به عنوان اساس مطالعات در زمينه كشت بافت قرار گرفتتاريخچهاولين بار در سال 1838 اشليدن و شوان تئوري Totipotency را ارائه نمودند. براساس اين تئوري ، هر يك از سلولهاي يك موجود پرسلولي اگر در شرايط مطلوب محيطي قرار بگيرند توانائي تكامل و تبديل شدنبه يك موجود كامل را دارند. بعدها اين تئوري به عنوان اساس مطالعات در زمينه كشت بافت قرار گرفت. اساس تئوري كشت بافت گياهي توسط هابرلنت فيزيولژيست شهير آلماني در سال 1902 پيشنهاد گرديد.وي اظهار داشت طبق مطالعاتي كه اينجانب انجام داده ام، مطالعه سيستماتيك سازمان يافته اي روي كشتسلولهاي رويشي ايزوله شده گياهان عالي انجام نشده است. او بر روي سلولهاي ايزوله فتوسنتزي برگ وسلولهاي متفاوت ديگر آزمايش كرد كه ناموفق بود. با اين وجود اظهار داشت كه مي توان به طور موفق جنين هاي مصنوعي حاصل از سلولهاي رويشي را كشت كرد. بنابراين او به طور واضح نظريه توتي پتانسيرا بيان نمود و نشان داد كه تكنيك كشت سلولهاي ايزوله گياهي در محلول غذايي، روش آزمايشي جديديبراي بررسي مسائل مهم است. براساس تحقيقات او در سال 1902 و بعد از آن، هابرلنت به عنوان پدركشت بافت گياهي نام گرفت.7

اسلاید 10: تاريخچهپس از آن در سال 1907 اولين كشت سلولهاي حيواني و انساني انجام شد اما در كشت سلولهاي گياهي پيشرفتي وجود نداشت تا اينكه در سال 1955 هورمون كينتين كشف شد و به دنبال اين كشف، كشت سلولها و بافتهاي گياهي رونق گرفت به طوري كه در سال 1958 تعداد آزمايشگاههاي كشت بافت گياهي در آمريكا و كانادا به بيش از 250 رسيد كه در هر آزمايشگاه سالانه بيش از يك ميليون گياه توليد مي گردد. اين رقم در سال 1985 براي هر 18 آزمايشگاه سالانه به 60 ميليون گياه رسيد. پيشرفت مهم ديگري كه در سال 1962 صورت گرفت معرفي و توليد محيط كشت MS (موراشيگ و اسكوگ) بود. اين محيط يكي از بهترين محيط هاي كشتي است كه امروزه نيز كاربرد دارد.8

اسلاید 11: تاريخچهسیر تکاملی پیشرفت کشت بافت:مرحله اول (1902-1892) هابرلند، ون وچينگ و رشينگر کشت بافت‏هاي گياهان مختلف در محلول‎هاي نمکي ناپ و غنی از ساکارزهابرلند فرضيه‏اي در مورد خاصيت توتي‎پوتنسي هر سلول گياهي زندهقابليت سلول‎های‏ گياهي به واقعيت بخشيدن پتانسيل نمو خود جهت تشکيل يک گياه کامل در شرايط خاص کشت بود پدر علم کشت بافت گياهي9

اسلاید 12: تاريخچهمرحله دوم (1922-1902)تهيه محيط کشت‏هاي اوليه جهت کشت بافت‏هاي حيواني با منشاء طبيعي داشتند و حاوي پلاسماي خون و مايع جنينيمرحله سوم (1932-1922)رابينز دانشمند آمريکايي و کوته دانشمند آلماني امکان کشت مريستم‏هاي انتهايي نوک ريشه گوجه فرنگي و ذرت بر روي محيط کشت‏هاي جامدمرحله چهارم (1940-1932)گاتريت، دانشمند فرانسوي امکان کشت موفق و مداوم بافت‏هاي گياهي هويج را در شرايط درون شيشه‏اي با انتقال متناوب آنها بر روي محيط کشت‏هاي تازه10

اسلاید 13: تاريخچهوايت بر روي توتون نابکرت اولين کشت بافت‏هاي واقعي و طولاني مدت از بافت‏هاي تمايز يافته هويجمرحله پنجم (1960-1940)کشف کلاس جديدي از هورمون‏هاي گياهي به نام سيتوکينين‏ها و به‎خصوص هورمون کينتين در سال1955 امکان تحريک تقسيم سلول‏هاي برش يافته بافت پارانشيم مياني توتونمرحله ششم (1975-1960) کوکينگ روش‎هاي آنزيمي جهت تهيه پروتوپلاست‏هاي منفرد حاصل از ريشه و ميوه گوجه فرنگي و کشت آنها در شرايط کنترل شده11

اسلاید 14: تاريخچهپاور و همکاران امتزاج مصنوعي پروتوپلاست‏ها باعث گشوده‏شدن راه جديدي در ايجاد هيبريدهاي سوماتيکيمورل دانشمند فرانسوي استفاده از ريزازديادي گياهان در شرايط درون شيشه‏اي با استفاده از کشت مريستم جهت تهيه مواد گياهي عاري از بيماري در گياه ارکيدهمرحله هفتم (1975 تا کنون)توسعه فناوري‏هاي درون شيشه‏اي تهيه انواع مواد بيولوژيکي مورد نياز جهت انجام کارهاي کشت بافت 12

اسلاید 15: خصوصيات آزمايشگاهخصوصيات آزمايشگاه كشت سلول و بافت:تعيين محل آزمايشگاه كشت بافت، تصميم مهمي است. آزمايشگاه نبايد در مجاورت آزمايشگاه هايي كه ازميكروارگانيسم ها و يا حشرات استفاده مي كنند يا محل ذخيره بذر و مواد گياهي هستند، تأسيس شود زيرا انتقال آلودگي از طريق دريچه هوا و رفت و آمد زياد، مسئله ساز مي گردد.رفت و آمد زياد موجب بالارفتن غبار از كف زمين شده و به گسترش آلودگي كمك مي كند. ازقراردادن گلدان حاوي گياه در فضاي آزمايشگاه كشت بافت اجتناب شود چون مي توانند منبعي از كنه ها و سايرموجودات آلوده كننده ديگر باشد. بلافاصله بعد از پايان كار در مزرعه يا گلخانه، نبايد وارد آزمايشگاه شد. زيرا احتمال ورود كنه و حشرات چسبيده به مو يا لباس به داخل آزمايشگاه وجود دارد.13

اسلاید 16: تجهيزات آزمايشگاهيتجهيزات و وسايل لازم براي يك آزمايشگاه كشت بافت به شرح زير است:اتوكلاو، از اين وسيله براي استيل كردن محيط هاي كشت و وسايل شيشه اي استفاده مي شودطرح شماتيك از يك اتوكلاو14

اسلاید 17: تجهيزات آزمايشگاهي*دستگاه لامينار ايرفلو يا هود استريل ، مولدهواي استريل مي باشد. هنگام كشت ، گياه رازير هود استريل كشت دهيد.15

اسلاید 18: تجهيزات آزمايشگاهيمواد شيميايي، منظور محيط هاي كشتي است كه براي كشت استفاده مي شود. محيط هاي كشت عموماً داراي عناصر ماكرو و ميكرو، ويتامين، هورمون ، قند و آگار مي باشد پس از تهيه محيط pH آن بين5- 7 دستگاه آب مقطرگيريآون )فور(، وسايل فلزي توسط اين دستگاه استريل مي گردد. 16

اسلاید 19: تجهيزات آزمايشگاهياتاقك رشد يا Growth chamber در اين اتاقكها از لامپهاي آفتابي و مهتابي استفاده شده و دما طوري ،تنظيم مي گردد كه تا حدود 25 درجه سانتيگراد باشد)با استفاده از تايمر مي توان فتوپريد مناسب را برايهر گياه را ايجاد نمود.)Hot Plate Magnet در تهيه محيط كشت از اين دستگاه استفاده شود. p H متر17

اسلاید 20: تجهيزات آزمايشگاهيترازوي حامل، حساسيت آن بايد از 0/ - 001 باشد تا موادي با مقادير كم(مانند هورمونها) را نيز بتوان وزن كرد. شيكر ، در كشت مايع از آن استفاده مي شود.مواد لازم براي استريل كردن جداكشت، محيط كشت و ابزار كار (شامل هيپوكلريت سديم و الكل اتيليك70%)منبع گاز دستگاه لاميناريخچال و فريزر18

اسلاید 21: دستگاه لامينارايرفلو اتاقك استريل (دستگاه لامينارايرفلو)گرچه آماده سازي و قطع قلمه ها، قطعات كالوس و غيره، در يك ظرف شيشه اي و يا در بين فيلتر كاغذي استريل انجام مي شود، ولي انجام اين كار در اتاقك استريل ضرورت دارد. هنگامي كه اعمال فوق در يك فضاي غيراستريل انجام شود ميزان آلودگي افزايش چشمگيري مي يابد، حتي اگر از كاغذ استريل جهت كار استفاده شود. اتاقك استريل محلي است كه هواي مكيده شده از خارج قبل از ورود به آن ، با عبور از فيلترهاي بسيار ريز، تصفيه مي شود. اين سيستم تصفيه جرياني از هواي استريل ايجاد مي نمايد، همچنين به منظور ضدعفوني خشك از چراغ الكلي يا چراغ گازي استفاده مي شود19

اسلاید 22: استريل كردنكلياتي در مورد استريل كردن:استريل كردن شامل استريل مواد گياهي ) جداكشت ها ( ، محيط كشت و ابزار مورد مصرف در كشت سلول و بافت مي باشد. در مورد مواد گياهي يا جداكشتها، ابتدا سطح اندامي كه قرار است به عنوان جداكشت استفاده شود )مثل شاخ و برگ يا ريشه(.... را با مايع ظرفشويي شسته و به خوبي آب كشي كرده سپس جداكشت مورد نظر را تهيه و در محلول هيپوكلريت سديم (وايتكس) قرار مي دهيم. باتوجه به نوع گياه و نوع جداكشت ، تيماري كه براي استريل كردن استفاده مي كنيم ، متفاوت است. به اين معني كه رقت محلول هيپوكلريت سديم و زمان قرار دادن جداكشت در آن بسته به نوع گياه متفاوت است (بايد توجه نمود تا نمونه تيره نشود.) لازم به توضيح است كه جداكشت يا Explant. (به قطعه اي از گياه كه در محيط كشت قرار مي گيرد گفته مي شود) را مي توان از تمام قسمتهاي يك گياه اعم از سيستم انتهاي ساقه، برگ، ساقه، ريشه و ... بدست آورد.از ديگر مواردي كه نياز به استريل كردن دارد، محيط هاي كشت مي باشد. پس از تهيه محيط كشت دلخواهآن را در شيشه هاي درب دار (شيشه هاي سس مايونز شيشه هاي مناسبي است چرا كه هزينه كمي هم دربر دارد) ريخته و در اتوكلاو استريل نماييد.توجه: درب شيشه هاي حاوي محيط كشت استريل تنها بايد هنگام كار در زير دستگاه لامينار (اتاقك استريل) باز شود.استريل كردن ابزار كار نيز از جمله مواردي است كه بايد رعايت گردد. ابزار فلزي مورد نياز از جمله دسته تيغ يا قيچي و پنس را داخل فويل آلومينيوم پيچيده و در آون با حرارت 200 درجه سانتيگراد به مدت يك ساعت استريل كنيد. ظروف پتري را نيز مي توان مشابه ابزار فلزي استريل نمود. هورمونها و برخي ويتامينها كه به دماي بالا حساس هستند را بعد از استريل شدن محيط كشت و در زير دستگاه لامينار با استفاده از فيلترهاي غشايي به محيط كشت اضافه نمائيد.20

اسلاید 23: تيمارگرمائي  Heat Therapy، تيمارگرمائي تيمارگرما براي خلاصي از عوامل آلودگي در گياه استفاده مي شود. يكي از مهمترين عوامل آلودگي، ويروسها مي باشند. گياهان و ويروسها واكنش يكساني به تيمارگرمايي نشان نمي دهند اما بايد تعادلي به وجود آيد كه هم به گياه اجازه رشد داده شود و هم بيشترين ميزان حذف ويروس را داشته باشيم . همانطور كه مي دانيم در شرايط رشد طبيعي به موازات رشد انتهايي ساقه، ويروس نيز به بافتهاي جديد منتقل مي شود. اگر گياه بتواند در درجه حرارتهاي بالا رشد كند، در اين صورت احتمال كاهش سرعت همانند سازي ويروس وجود دارد و در نتيجه انتهاي ساقه مي تواند سريع تر از ويروس رشد كرده و عاري از ويروس گردد. سپس مي توان انتهاي ساقه را كه عاري از ويروس است، قطع و آن را كشت نمود. دمايي كه معمولا استفاده مي شود 36 تا 37 درجه براي چند روز (تا 7 روز( در ماه است. استفاده از برخي مواد شيميايي در محيط كشت نظير. Ribavirin نيز منجر به توليد گياه عاري از ويروس مي گردد 21

اسلاید 24: محيط كشت و تركيبات آنانتخاب محيط كشت براي موفقيت در كشت بافت ضروري است . هيچ محيط كشت مشخصي را نمي توان براي رشد انواع سلولها توصيه كرد و اغلب لازم است تغييراتي در محيط كشت براي پاسخگويي انواع مختلف جداكشت صورت گيرد. مسير تعيين يك محيط كشت به هدف كشت سلول و بافت بستگي دارد. به طور كلي محيط كشت حاوي نمك هاي غير آلي و تركيبات آلي مثل تنظيم كننده هاي رشد، ويتامينها كربوهيدراتها و يك عامل ژله اي كننده محيط مي باشد، علاوه بر اين محيط كشت مي تواند داراي اسيد آمينه و آنتي بيوتيك نيز باشد.22

اسلاید 25: محيط كشت و تركيبات آن اجزاي محيط كشت بافتهاي گياهي به شرح زير است:الف) نمك هاي غيرآلي و مواد معدني*براي رشد بافتهاي گياهي كشت شده ، تأمين مداوم بعضي از تركيبات شيميايي معدني در محيط كشت ضروري مي باشد. كربن، هيدروژن، اكسيژن، فسفر، پتاسيم، كلسيم، منيزيم و نيتروژن به مقادير نسبتاً زيادي براي رشد و نمو بافتهاي گياهي ضروري مي باشد.*نيتروژن كه بيشتر از ساير عناصر مورد استفاده مي باشد به صورت نيترات يا يون آمونياك و يا تركيبي از آنها به محلول غذايي افزوده مي شود. سولفات منيزيم نياز محيط كشت به دو عنصر منيزيم و گوگرد را تأمين مي كند فسفر را مي توان به صورت فسفات منوسديك و يا فسفات منو پتاسيك به محيط كشت اضافه كرد. به منظور تأمين كلسيم مي توان از كلرور كلسيم يا نيترات كلسيم استفاده نمود.23

اسلاید 26: محيط كشت و تركيبات آن( MS) 3 تركيب محلول هاي ذخيره پنج نمك غيرآلي فرمولاسيون موراشيگ و اسكوگ - جدول 1ماده شيميايیغلظت(گرم در ليتر محلول ذخيره)ماده شيميايیغلظت(گرم در ليتر محلول ذخيره)محلول ذخيره نيترات KI0/083NH₄NO₃165CoCI₂.6H₂O0/0025KNO₃190PBMO محلول ذخيره   KH₂PO ₄17محلول ذخيره سولفات H₃BO₃0/62MgSO₄.7H₂O37Na₂MoO₄.2H₂O0/025MnSO₄.H₂O1/69NaFeEDTA محلول ذخيره ZnSO₄.7H₂O0/86FeSO₄.7H₂O2/784CuSO۴.5H₂O0/0025Na₂EDTA3/724محلول ذخيره ھالوژنھا(ھاليدھا)   CaCI₂.2H₂O۴۴  درجدول1-2 3 محلولهاي ذخيره پنج نمك غيرآلي MS نشان داده شده است. اين محلولهاي ذخيره با غلظت 100 برابر غلظت نهايي محيط كشت تهيه مي شوند. از 10 ميلي ليتر محلول ذخيره براي تهيه 1000 ميلي ليتر محيط كشت استفاده مي گردد.24

اسلاید 27: محيط كشت و تركيبات آناز فرمولاسيون موراشيگ و اسكوگ(MS) به طور گسترده اي استفاده مي شود و هدف از تهيه اين محيط كشت )كه به مقدار نمك هاي آن توجه خاصي شده است(آن است كه نشان دهيم اضافه نمودن عصاره بافت هاي گياهي (كه قبلاً به محيط كشت اضافه مي شد)؛ رشد سلولي در كشت درون شيشه را افزايش نمي دهد و مواد غذايي غير آلي معادل، محدود كننده رشد سلولي نيستند. ب)تنظيم كننده هاي رشدتنظيم كننده هاي رشد ( يا هورمونها) تركيبات آلي هستند كه به طور طبيعي در گياهان عالي ساخته ميشوند و بر روي رشد و نمو اثر مي گذارند. در كشت درون شيشه گياهان عالي، نقش تنظيم كننده هاي رشد ( و از همه مهمتر اكسين ها و سيتوكسين ها) بارز مي باشد و در اغلب موارد كشت درون شيشه بدون حضور تنظيم كننده هاي رشد غير ممكن است . بايد دانست اضافه كردن هورمون به محيط كشت بستگي به نوع قلمه و گونه گياهي دارد . به عنوان مثال قلمه هايي كه خود اكسين كافي توليد مي كنند، به اكسين اضافي براي رشد و تقسيم سلولي نياز ندارند.25

اسلاید 28: محيط كشت و تركيبات آن اكسين ها:اين هورمون باعث رشد طولي سلول ، تقسيم سلولي ، تشكيل ريشه هاي نابجا و ممانعت از تشكيل شاخه هاي نابجا و جانبي مي گردد. در غلظت هاي پايين اكسين، تشكيل ريشه هاي نابجا تحريك شده در حاليكه در غلظت هاي بالاتر كالوس زايي تحريك مي گردد. از مهمترين اكسينهائي كه به ميزان زيادي در كشت بافت استفاده مي شود ايندول بوتيريك اسيد (IBA) مي باشد. اين اكسين در محيط كشت به موقع تجزيه مي شود (اكسين ها بايد حداكثر پس از 5 روز در محيط كشت تجزيه شوند) از ديگر اكسين هاي رايج ميتوان از ايندول استيك اسيد يا IAA (زودتر از حد معمول در محيط تجزيه مي شود)، نفتالين استيك اسيد ياNAA (ديرتر از حد معمول در محيط كشت تجزيه مي گردد) و 2 و 4 دي كلروفنوكسي استيك اسيد(D- 4 و2 ) براي القاي كالزايي و از NAA وIBA ،IAA براي ريشه زايي استفاده مي گردد. سيتوكنين ها:كينتين، بنزيل آدنين (BA) زآتين- 2 ايزوپنتيل آدنين ( 2 ip) از پر مصرف ترين سيتوكينين هايي هستند كه در محيط هاي كشت گياهي به كار مي روند. اين هورمونها غالباً براي تحريك رشد و نمو به كار مي روند.سيتوكينين ها در غلظت كم (1/0ميلي گرم در ليتر) باعث توليد كالوس و در غلظتهاي بيشتر(10-1ميلي گرم در ليتر)شاخه زايي را تحريك مي نمايند.26

اسلاید 29: محيط كشت و تركيبات آناسيد جيبرليك: اين گروه شامل حدود 60 تركيب است كه GA3 رايج ترين آنها در گياهان است. اسيد جيبرليك به ندرت در كشت بافت استفاده مي شود. نقش اسيد جيبرليك عموماً در تحريك جوانه زني بذر و تحريك رشد طولي ميانگره هاست . به طور كلي اثر اين هورمون در محيط هاي كشت ، تحريك طويل شدن شاخساره هاي خيلي كوچك و تحريك تشكيل جنين روي كالوس مي باشد اسيد آبسيزيكABA: اين تنظيم كننده يكي از مهاركننده هاي رشد محسوب شده اما در كشت بافت در تحريك نمو جنين از كالوس نقش دارد و از آن به ندرت در جنين زايي سوماتيك استفاده مي شود. اتيلن: از اين هورمون در كشتهاي invitro جهت جوانه زدن و تمايز سلولهاي چوبي استفاده مي شود.27