علم ژنتیک

صفحه 1:
In the name of ALLAH 

صفحه 2:


صفحه 3:
Under supervision of Dr.FATHI exercise ma ۵ university of mazandaran 

صفحه 4:
صورت جفتي هستند و روي یک کروموزم صدها و يا شايد هزاران زن وجود دارد.زن تا شده اند 

صفحه 5:
ژن ها و کروموزوم rs creas ellen ‏تلا ان‎ ۳۳ a US) PROS Ee Re ‏ا‎ EES PELE Ly ‏متابولیزم 0006 :سلامت 000 بیشترین اهمیت را برای‎ | ‏سلول دارد كه آن را مىتوان از بيجيدكى و كثرت سيستم هاى‎ ‏آنزیمی شرکت کننده در همانند سازی , ترمیم و نو ترکیبی‎ 30 eae) ‏ا‎ ak ONO Mew] ‏ا ا ل‎ O1C) ee ane eC Se es eS ‏ا‎ رسد. 

صفحه 6:
۳ Crp. a hamD / pC Hatete AeP RU NTUL eT DIES Loree ete) 61 0M (CC Bevarverrel fy \ ‏شامل اتصال ©0000 يليمراز به يى جايكاه 00008 به نام‎ يروموتور ‎٠‏ شروع سنتز رونويسى , طويل سازى و خاتمه » لال 70 eM reno Lee Ste A FPP PPR OC HERCS PENS ترجمه اطلاعات کد شده در ‎RO®‏ سنتز می‌گردند. 

صفحه 7:
۳ ۳ تاریخچه ژنتیک ‎٠‏ كريكور مندل در سال 1865 قوانين حاكم بر انتقال صفات را كشف كرد. ‏در سال 1900 ميلادى كشف مجدد قوانين ارائه شا سک ار 0 «شرماك» و «كورنز» باعث شد كه نظريات او مورد توجه و قبول قرار كرفته و مندل به عنوان يدر علم زنتتك شناخته شود. ‏در سال 1953با کشف ساختمان جایگاه ژنها ازسوی جیمز واتسن ۱0| ‎eat‏ رشتهاى 9 رو وود آمد که زيست شناسى ملكولى نام كرفت. ‎ 

صفحه 8:
‎per Ey een)‏ م0000 92و ‎ee‏ ع كك 1 ‎A PRET‏ ‏* ژنتیک مندلی یا کروموزومی بخشی از ژنتیک امروزی اسك إر توارت رهاق ‎eae)‏ ل 0 بحث مىكند, اما برعكس در ‏زنتيك غير مندلى كه به زنتيىك 1 7 20 است, توارث مواد زنتيكى ‎peor re ME ere ae)‏ ‎Pee eee meCe reir]‏ تحلیل قرار می‌گیرد. ‎ ‎ 

صفحه 9:
۹۱۹8 

صفحه 10:
مقدمه ‎FEET PR DCU NO CMEC PCH IST IPT‏ نمودن الگوی بیان ژنهای مورد نظر در شرایط متفاوت و همجنين براى تعيين ساختار 080009 استفاده می شود. بايد توجه داشت كه 0820-05008) يى تكنيىك پیچیده ای ا ل 0 لك ‎revel‏ ل 0 ‎ST)‏ ا ا ا ا | این عوامل ‎Siw‏ دارد. 

صفحه 11:


صفحه 12:
ما سا رم هط Heat ‏که ما‎ W_ONA Strands will seperate A/C TS ه ۱۳:1 تداع کالم 1-1۳1 مره W Primers bind to template DNA strands ASS 1 A Sle) A AGE T Alo = S TGAC (۲ eee, FEO Taq polymerase synthesizes new DNA strands ce eee ey 2 5 = = ———E ‏أ‎ 5 = 0 ‏اس اس ا ص مسر سا د د ةا‎ 

صفحه 13:
بيان زن بیان ژن فرایندی است كه در آن اطلاعات درون زن از ار ۱ دست أيد. 

صفحه 14:
مثال ساده از تنظیم بیان ژن PHO ‏ا‎ CS GPEC Erol 1 ee mor ers aete ne] RCo oe ‏تواند ازلاكتوز (كلوكز+كالاكتوز)نيز براى تأمين انرزى‎ ‏استفاده کند. پس درفقدان گلوکز اين باکتری نیاز به آنزیم‎ ‏های جذب و تجزیه لاکتوز دارد. بنابراین در صورت وجود‎ 0 ‏ا‎ ‏خاموش است ولی وقتی که گلوکز در محیط نیست و‎ ‏لاكتوز وجود دارد زن مربوط به جذب و تجزيه لاكتوز بيان‎ [7 

صفحه 15:
‎poe) 7‏ زن در سلول 9 7 ار ار / ‏بر رو ها را ‏۰ تکثیر در آزمایشگاه می تواند چندین بار تکرار / ‏شود مثلا ‎e Raptr eC]‏ 2 تواند 5۳۳ بار ‏تكرار شود. ‎ee mee 8‏ 0 7 ؟ لا آزمایشگاه می ترل 0 : نگ ‎ 

صفحه 16:
‎(ON cd‏ ی ‏دستگاه ریل 0 ار(الكتروفورز) ‎ 

صفحه 17:
زروش اندازه گيري نیمه سه كس ۸ 110217 2 ANAS 5 ۳ ‏ال‎ 

صفحه 18:
۷ Introduction to PCR PCR was invented in 1984 by ( Kary mullis ) & he received the Nobel Prize in chemistry in 1993, for his / ‏ارزو‎ و 3 

صفحه 19:
۱ Tin hee] rs ٠ ‏(واکنشهای زنجیره ای پلیمراز) در آزمایشگاههای‎ ‏زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود. در اين‎ ‏روش با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان‎ wh pls! clean |, OO® 5455 auls * امروزه این تکنیک به عنوان یک روش قدرتمند در تشخیص بالینی برای بررسی وجود موتاسیون در ‎Sly L sill e915‏ 19 1 00 ژنها و همچنین تعیین غلظت مواد استفاده 

صفحه 20:
کاربردهای ۵6 

صفحه 21:
6 ا م۱۵9۳ دك لك 600086-00 (Cmca ah mat ata NC ‏يي ا‎ OxO)) WO theless depeudeat por 

صفحه 22:
RT-PCR (Qeverse A eNom cs OD) ‎OCIS ered re CBSE PREYS S|‏ تک زنجیره ای است. از ا ‎Pleo‏ ا 10 ا ‎[eee gegen monn] eect] F-1‏ ‎eee TOE Sew) eeleoee‏ 00 ‎OOOO (corrpecrestary DOP) yl LoXo RO SoS jl RT‏ سنتز می شود و بوسیله تکنیک ۳06) تکثیر می یابد. بمنظور تعیین گونه و حساسیت دارویی در ویروس شناسی و مایکوباکتریولوژی, از ا ل | ‎ 

صفحه 23:
=Short “target” product Long product or lUnamplifed ONA & 2 ین ‎x‏ = ‏هر‎ - ee ‏مه مهن‎ |۷۳ Maco maeeck Denature and anneal primers extend primers 

صفحه 24:
Oe ac Oxy * در اين روش بمنظور افزايش حساسیت 0۵ از دو جفت يرايمر استفاده مى شود. ابتدا با يك اول لب 15-0 چرخه, قطعات 

صفحه 25:
NESTED PCR: P1/P7 - RI6F2n/R2 

صفحه 26:
4 Ox در اين روش از جند جفت برايمر اختصاصى براى ‎mr me Dty‏ ا ا 0[ شناسى بالينى, با استفاده از اين روش امكان شناسايى جندين عامل بيمارى در يى نمونه بطور ل ا ات لكت 22 erin pis Yue es 

صفحه 27:
Multiplex PCR primer set design a ‏حح ارو‎ 1 soe |] No intraset overiap Intraset overlap Multiplex set A: <= سهد :8 ‎Multiplex set‏ ووو :فلم مم ممم ۵ C Simplex pair A13 rev. nested: Cam ‏سم‎ ‎‘Simplex pair A13 for. nested: ‏ت۲۲ سم‎ Mute seta: ae Matipex set 8 == B= Simplex ‏را‎ 

صفحه 28:
PROC-PCR (renee ni beara a ac) ‎we 5000-6‏ سى آر ‎yous sly (PROC-POR)‏ های نقطه ای بکار می رود و از دو جفت پرایمر 2900 واكنش در دو لوله جداكانه ‏ا ا ا 1 ‎ 

صفحه 29:


صفحه 30:
‎ed‏ المع موم ‎9 ۳0 006 2 3 ‏براى جداسازى 2 0000 استفاده مى شود ‎Isothermal amplification (~ 1h) ‎ ‎ ‎B Helicase § Polymerase ‎ ‎ ‎ ‎af ‏رم‎ ‎Electrode Electrode High current Low current ‎response response 

صفحه 31:
تخليص ©8000: مقدار 50 تا 100 ميلي كرم از بافت مورد نظر (كبد ‎A‏ ‏موش ...ارا با روش هموزنيزه كردن (با نيتروزن مايع) يودر كرده و با كيت مخصوص 00006 تخليص مي کرد سیس نا زمان استفاده از آن در ‎(RO‏ ‏7 

صفحه 32:
رد 1#" در استخراج 00009 بايد از دستكش استفاده كرد.زيرا سلول هاى مرده يوست 0000652 توليد ‎RM Monomer clr sates‏ بردن 07000052 حتى از طريق اتوكلاو كردن هم صورت نمی گیرد.پس آب و تمام وسایل باید از ‎ROOse .‏ شوند. ‎۱ ‏ا‎ err peer) ۳ ‏برای‎ a Pee ‏ب‎ ‏شود.‎ ‎00 ‏ل ا‎ pC TRC SUE | ‏55ت‎ ‎ 

صفحه 33:
تبدیل06 به 2008 ‎٠‏ ©0000 نمى تواند به عنوان الكو در ج5060) ‎Quy 29 orlaiwl‏ ا ا 2 00002 ‎sg) JI‏ ا ا ‎pw ub‏ این الگو با 068 به صورت نمایی تکثیر یافته و ‎PY Pee weT1bC] NORCO) 67) ‎Contaminations ‎removed by R ‎ 

صفحه 34:
دللايلتبديل 00009 به 20000095 ا ا 0 ال 0 ‎COO®‏ ‏تبديل شود) *از میان انواع 4۲00 فقط 0۲0 به 70600 تبدیل می شود 1 ‎PSST pI aed mee err COME) Ise TEP ree (Ce)‏ در محیط بیرون یخچال بماند خراب نمي شود. 4-آنزيم ۱ نمي تواند 690 را به صورت الگو قرار دهد لذا ۱0 ‏ا‎ OT onT Eat eel DO (ura Dptev-bhastosts Oin) 9 , مولکول 80069 به (70000 تبدیل مي شود و سپس ۳۰۲) معمولي انجام مي شود 

صفحه 35:
ا 00 011 مح تا ۳ يننا تن 2 رن ۴ ۱۱ تطلان 

صفحه 36:
tefl stewphie OOO: OOB 1 $2» SOO@oLY ‏اسنکه تکثیر م نا‎ 0000-2 onward sbpoly ‏به كونه اى طراحى شده اند كه هر يى مكمل‎ cn O® sb ‏ناحیه ۳ دز یکی از رشته‎ (le; Pag ‏رم‎ ‎BY Se eRe ar ‏ا‎ PR ‏ا‎ 1 ea 7 eo ~ ‎Cae AW ON Ucn‏ نا ‎ 

صفحه 37:
2 )00 ۳۵2 Por DO, ONPs For RO) ۷ aye ares hy Ua ‏ی‎ mute are ae رت تلا 1 ‏و‎ S)i,9L glare ‘Duff 100 ‏اد لیط محیطی‌مناسبیرا از نظر 7۷۷ و یونهای‎ 7 5 م آنتا مین‌شود. اننا *وبال (ميكروتيوب):لوله هاى كوجى آزمايشكاهى ل 000 را را از ويال 

صفحه 38:
as ‏مراحل‌دستگام00<)‎ ‏بح سل *: مرحله شروع‎ 94 ‏تا 9 دقيقه دماى محلول به 9 تا ع9 درجه (يا‎ ١ ‏به مدت‎ 000 ‏ا‎ jlo 51 a2 > ‏ميشود. اين مرحله فقط براى 00009 يليمرازهايى ضرورى‎ Spe Os boas rere ne CU mts rE tmorn)| 200 0300 eet eee ‏ا‎ racic ral Oe ‏دما:94 درجه سانتي گراد‎ ‏زمان:30 ثانيه تا يك دقيقه‎ 220 ‏م ا 00 ا‎ 0 00 ‏ل ا ا‎ ‏رشته هاى 00009 حاصل‎ SG 9 ‏جدا میشوند‎ میگردد: 

صفحه 39:
2( ار ل ل 0 زمان:30 ثانيه تا يك دقيقه ‎SP aoY IP)‏ م ا ا ا 30507 ‎en ey es‏ رز باثين تر از نقطه ذو ‎eer bn‏ ا 20000 ‎Pais =P Cg Fe‏ ال 0000 ‎rand ev eeTeas pel FOP ea enter CCRC CRN PCOS‏ هيبريد يرايمر-الكّو. همانند سازى 00000 را اغاز ميكند. .3( ل 0000 پا گراد 0000 sb HOPE jl oolauwl L jel OOP a5 ale. yl 52 موجود در محلول, یک رشته )ی جدید را در جهت ۵ به ۳ مقابل رشته های الگو می سازد. در دمای بهینه, 00 ‎ev CURE VES pet Ce Dis] bt OCR TTC DIC EN IS|D‏ 

صفحه 40:
‎Ly cSt ap)‏ ا ا ا اك و تامين شرابط بهينة, مقدار 6086© در محلول :6600 دو ا ا م اناك ‎srtblai wg‏ ل 0 اين مرحله: يس از آخرين سيكل 6008 به مدت 0 الى 0 دقيقه در دماى ‎٠١‏ الى لا درجه انجام ميشود., تا را ‎Bee‏ ‏سازی شده اند. *لادا امه : نكهدارى نهايى ‎isp)‏ ا ا ۱ ‎dl‏ ا 0 ‎ee See ia‏ نهاينا ميتوان محصولات 00# را بر روى ل آكارز و ار 1 ل ل 22 0 200 ‎ere]‏ 5 ا ل 002007 ‎ ‎ ‎ 

صفحه 41:
0 ۰ i ۰ ۰ 0 ۰ ۰ 8 ۰ 0 oui ‏و‎ ۰۰ eee, ‘ 60 .,? “Cus ۲ ‏و‎ 

صفحه 42:


صفحه 43:
REACTANTS for cl sequencing Cycle sequencing ae ‘Mader automated DNA sequencing machines use a process called ۲ ۰ ‘ye sequencing. Thi is smi tothe PCR in tat template DNA (0 (whichis to be sequenced), riers, dNTPs end the enzyme DNA am Fen NTF pohmerase are used Sore dANTPs ddeaqrcketietibosphats, ul wth 0 G,C.A oT bat) are ao inched in he racon mi. Each ee Our ANTPisabeled with aflurescent de, and the DNA stand camot 3 8 3 2 be extended beyond one of these fluorescent bases. The fragments ‏سوه “نيم‎ produced re un on ayy el wich dense enough to noble fogments that derby a single bose to be distinguished Tamssble Fines ‏ل‎ Consquerty, edi the gel (hich canbe done bya scanning loser) rea the sequence of base nthe template DNA strand. ELECTROPHORESIS GEL The base pu sequence i rad inthe oppose drectonto the ‎j nein which the gels un,‏ ی ‎[DNA fagmens the ands of which arelbeled with orescent bass, are produced inthe reaction ‎These are separated by ste on an lactrophoresi a ‎ ‎ 

صفحه 44:
1 0 ‏ا ا‎ 6 ‏ا‎ rere SOS eres br) BUS] en (gtr) [0 TIES Ren eee ir Cae TT CST) Ve VEL ES PS perce 000 0 ‏ا ا‎ On rey ۱ ‏ا‎ ere rears pe [a ‏پر‎ | ‏ا‎ cee ae 1 cae Tel Ep] eC S/Prcroe cnt AaeC Ny ee eres ‏ل‎ ‏ا‎ ce OSB ver) نام برد . 

صفحه 45:
اال اب كد رزوي رف 1 دور 7 ‎uilGl a) Peer eee‏ 1 4 ۱ 1 ‎Se‏ 00 ذرات در یک مایع تحت میدان الکتریکی ‎Ras‏ ‏لغت فورز به معناي حرکت و تحرك است و ۳ و ~ 

صفحه 46:
ل 20 0 ا 7 7 0 7 دا ای ‎Aesth Mal es Uh‏ خواص فيزيكى مانند شكل فضايى, وزن مولكولى ‎ice‏ 7 7 ۸ 

صفحه 47:
نماي ساده از دستگاه ‎SECU Pree‏ ‎hed 77‏ خلاء: 35 الكترود منفي و يك الكترود مثبت در دو طرف ذره باردار مي باشد. اسيدهاي نوكلئيك داراي بار الكتريكي هستند. ات اسيدهاي نوكلئيك داراي بار م 0689 رشته :داراي بار الكتريكي منفي ه (©008 داراى شارز منفى ‎١‏ ‏22 ا 2 ‎G sw L unaic ules‏ ۱۳ 

صفحه 48:
ار را را 5 کار ار ۱( ۲۱۱ باشد ذره موردنظر به تنهايي و با سرعت شتابدار تا رسيدن به الكترود مثبت حركت كرده و برقراري جريان 1 وفقي کل ار است با به ری جرباناالکتريکي فطع مي ‎x‏ الكتريكي در تانك الكتروفورز همواره از الكترود منفي به سمت الكترود مثبت است. البته اين مطلب در مورد رشته 01008 كه داراي بارالكتريكي م 

صفحه 49:
تحرك الكتريكي معيار اصلي سنجش در جداسازي مولكول وا را ۱ تحرك است. درحالي كه وجود بار باعث زودتر رسيدن ذره به قطب است. هرجه ذره بزركتر باشد و شكل آن از حالت كروي دور باشد ضريب اصطكاك ‎١١‏ بيشتري داشته و تحرك الكتريكي كمتري داراست. درواقع تحرك الكتريكي هر ذره وابسته به شكل و اندازه ا ا 2 2 كه ارتباط مستقيم با اندازه و شكل ذرات دارد هرجه ذره به شكل كروي نزديكتر باشد ضريب اصطكاك كمتري دارند. 

صفحه 50:
۱ ا ا ل ل 30 نشانداركردن قطعات با يرب هاى راديواكتيو كار مى كند و ا ا ‎L WL cywlur oF cul‏ 8 1 EE Bela] cel ec peer ere tsee tS) bC) lem ‏اندازه گیری چگالی:تراکم باند 00 بر روی ژل آگارز رنگ‎ 2 ‏ا ا ا‎ nC eer ‏كزارش كنند. كر جه اين روش از حساسيت دو روش فوق‎ برخوردار نيست ولى در بسيارى از موارد كاربرد فراكيرى دارد . 

صفحه 51:
يك 

صفحه 52:
وسایل 9 در 7 الکتروفورز: ‎pacer pian‏ Cee a Rac te 

صفحه 53:


صفحه 54:
5. ماكروويو 

صفحه 55:
(جهت برقراري جریان الكتريکي در تانك الکتروا 

صفحه 56:
‎all,‏ يودر آاكارز: 2 07 : اتیدیوم برماید ‎pyre eres) erent 9)‏ قوي است) ‎TOE Ux .3‏ 

صفحه 57:
‎ee RCE ea‏ 0 د. این ‎aw cll, 0 peace Rel Lee weep)‏ اندازه قطعه مور 1 ا ‎Dyes Eee ord‏ 00 الرحسب اندازه قطعه زل 1؟ ‎w‏ 90 ‎SRT cera‏ ل ‎pO en‏ )71 استفاده كمتزين درصد ل آكارز در حدود ( ‏مي باشد. 

صفحه 58:
CRG 0 pen ‏:(أتیدیوم‎ etre] Reve Ree wous) Were Rowe] Rept e a ee ‏بخارات آن بايد يرهيز نمود و يسمانهاي مرتبط با‎ Lgl jaw ‏ا ل‎ ppl ‏لك‎ Reed a cre eee Re Teo ‏شيميايي اين ماده م2۳مم‌نایمه مي باشد. وزن‎ EULER ane =a > UC Beir Cerne SLT) 

صفحه 59:
‎ae‏ ما رم ‏ترکیبات این ماده عبارت است از برموفنل و سوکروز و ‎yer ee renee eC)‏ ل دق و وزن مولكولي 3/342-.«() حركت اين رنك نشان ‎ratty)‏ 1 ‎Se ‏ا‎ PURO eed ee ApS ee Roe ee . ‏محلول در داخل زل است‎ ‏سوكروز 9640 و برموفنل 9925 را با يكديكر مخلوط ‎Eee‏ ا ا ل لي لل عام ‎ 

صفحه 60:
(۳۹_۹7 تركيبات اين ماده به قرار زير است. تريس, ‎COVES‏ ‏, بوريك اسید 

صفحه 61:
/ 9 oe 1. يودر اكارز را وزن كرده و درون بشر يا ارلن بريزید. / 2 بط ۳00۵ را که در دسترس است توسط ‎Sew wih‏ 1250 

صفحه 62:
(Cust) cuwS $9) y |b (Cowb) ‏كمب‎ . 8 موردنظر قرار دهید و فاصله بين 9 ‎oe‏ زب ابن 0 7 ۱۵ $9 Pe keer Pele) 

صفحه 63:
‎Qululy lL) POC kk .4‏ 00 7 استوانه مدرج داخل ارلن يا بشر ريخته و به ‎GrTTy|‏ 0 ‏5. محلول داخل ارلن را در داخل ماكر 1 داده يا بجوشانيد بطوري كه ذراء ‎١‏ ‏كاملاً حل شده و ذره اي داخل ‎١١‏ 1 ‎rie‏ 500 ‏و سيس محلول موردنظر را سرد ‏6. به محلول درون بشر در حدود ‏(©-0) از اتيديوم برومايد توسط ‎| Epvevery ‏7. محلول را تكان دهيد تا اتيديوم ‏بروماید کاملا در آن حل«شده و ‏محلول یکنواخت 520 ‎ ‎ 

صفحه 64:
[0 TROT SP EOL Eo 8 9 2 ‏ريخته ودر حدود (520090 صبر‎ 31 

صفحه 65:
9. زل را به همراه 2 داخل تانك ۱ ۱ قرار دهيد و جاي أن را ثابت كنيد و سيس ‎Bas It Freecall PO A‏ 10100 ‎Reet‏ و000 

صفحه 66:
طريقه ران كردن ‎Provedure)‏ ۹ ‎el‏ به تيوبهاي حاوي نمونه به ازاء هر ا9 از نمونه م ا ا به آن ‎aslol‏ کرده و خوب ف ‏درون هر ءط؛ را داخل ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‏راست از ژل مسنم كنيد و در اخرين جاهك نيز مار را ران کنید. 

صفحه 67:


صفحه 68:
4 پس از 00-6 5 دقیقه ژد را از تانك ‘ ‎ee es‏ | دهيد. 0 در داخل دستگاه ژل را بگیرید Subjoct Subjoct Subject 3 

صفحه 69:


صفحه 70:
42 ۱ FIN Serra ‏ژل را از کست خارج کرده و داخل دستگاه اظ)‎ -1 Oe ‏ا ال ا ا‎ he Ere y Pe pCR (a / 0 Bors LCrtn) 

صفحه 71:
2- مانیتور را دوشن کرده و ازطریق مانیتور محل قرارگرفتن ‏ "م 99 ‎ie]‏ ا ا ل ا 10 1 نمایان شوند. ‎aul L -4‏ )+( 9 0 

صفحه 72:
لي جه ار ‎cece)‏ ل ا م بگیرید: ‎i)‏ شرس | ‎ee a a‏ ۳ 5 او 

صفحه 73:
‎StF a ee] ar ern EPs |‏ 1 ‎OC ae a eee) O‏ تغییرات و موتانتها را تشخیص داد و یا حتي وجود یا عدم وجود 20(0) رایتر را مشخص 1 ‎ 

صفحه 74:
Figure S-2: Gel Electrophoresis DNA Sample 4. Resticton enzymes deave DNA into smaller segments of varous sizes, 2 DNAsegments are loaded into wells in a porous gel. The gel floats in a buffer solution within a charnber between two electrodes, 3. When an electric curent is passed through the chamber, DNA fragments move toward ۵ 0 the positively-charged cathode. 4 Smaller ONA segments move faster and farther than larger DNA segments. 

صفحه 75:


صفحه 76:
روش اندازه گیری کمی REBL TIDE PCR ۷ 4 : ۳ ۱ | \ 2 نك" . الع 

صفحه 77:
Qed Tie PCR 0 dio POWs ‏ا ا‎ ben Fat Ste See We Trt) ‏رسكن يقنوانايق روش اتقلابى تنبيت كرده ابينات ..تكنيق هاى‎ Retire Sire SVK ‏ا‎ ry ere eR er eC ROCK CE CPEN ‏ا‎ Rory ROS Ye (UP ENC BCD err el MULL Bte wT SET) رشد وتكامل أن دائم در حال رشد ومورد توجه است . ‎NC eae Bea‏ ا ا ل ا ا ا كت ‎۱ ‏ولس‎ rr uly apron ric. ‏200 بود. قدم بزركى ‎Rh MN ae eee oe Tse‏ اس ترين وتخصصى ترين روش كه ‎ 

صفحه 78:
0 ‏ل ا ا ل‎ A Ose Ly) ‏نمودار در حين زياد شدن تعداد كيى هاى توالى مد نظرتان‎ ۳ ‏ا ا‎ ss) 0 

صفحه 79:
0 0 (Nery همزمانت حنپ وشش‌دامنه اعاز سیکلها از | هاعف لورسانت از يكيا جندينواكنشزنجيره اىيليمراز بصورت / سيكنال هاى فلورسانت از هر واكنش , ‎PIO AL)‏ ا 0 00 اندازم کسوس سس 5 

صفحه 80:
7 ۱۱۹ loi SK oul L POR Go Sy ojlail / (evened barcee cee eee] UME OCHO ERS ‏رونویسی کننده معکوس شروع شد . دو نوع آنزیم 4۲۱ در‎ Berrie nr ee Sect sa (OMB trent Sele T0816] 0 ‏وهمكارانش در سال 2004 وآنزيم 000:0 توسط زرارد‎ / 0 

صفحه 81:
ا 2 || ]||| || و ‎as‏ 7 ۳ ای ‎er‏ كاربردهاى لا ل م0 ‎٠‏ . تعيين تعداد كيى از هر ژن: 2007 ,دا۷۷: ‎Man® Gene Copy Number‏ ‎ ‎ ‎Protocol for 7900HT ; ‎Giulietti, 2001:y 5 ole olive Yuri 2° Leung, 2005 » ‎S Ieee] Oe Senge Soo‏ 0ك ‎9 Rajeevan, 2001 ation of Array Results Page b ‎ ‎ 

صفحه 82:
;Leruez-Ville, 2004 ‘leg jlo ‏مانيتورينك‎ ‎;Burger, 2003 ;Brennan, 2003 ا ری دای ای در 1 Kogure, 2004 CEA ed Bnei rasa ra OO) 2566 ‏ادك انجام‎ ۱ Barletta ;Adler, 2003 :(1PCR) Saas Lind & Kubista, 2005 ;, 2004 (ae ‏رسوب كروماتين با استفاده از اتصال‎ .7 *» ;Braveman, 2004 :.s9b Gil-yj Gill lype ;Wang, 2004 ;Sandoval, 2004 Puppo, 2005 ;Potratz, 2005 ;, 2005 ° 8. لت تنه 3م ‎Espy, 2006 ;Mengelle, 2003‏ 

صفحه 83:
‎dolgs lulu .9 *‏ ا ‎;Kearns, 2001a :CMO wll *‏ ‎;Kearns, 2002 ;Kearns, 2001b‏ ‎Mengelle, 2003 POT CT Cree Ta STs) Beng Fete e 2 Bryant, 2004 ۶ ۰ ‏بررسی حساسیت استریتوکوکوس پنومونیا به‎ * Kearns, 2002 : gulw wy COSMOTE Boren Teel Telemed ec) e Torres, 2003 ;Kraus, 2001 ‏های مقاوم:‎ Hazbon, 2004 ;Cleary, 2003 ; 0 ‏ا‎ MUSE T A Guy, ;Foulds, 2002 ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ 

صفحه 84:
:)0006 ‏اندازه كيرى 30007 آسیب به‎ .10 ٠ Dietmaier, 2001 asl Lb gwloi yl yo Yuri phil RO Blakely ;Blakely, 2001 ‏رادیواکتیو:‎ ‎Grace, 2003 ;Grace, 2002 ;, 2002 CIPI ES seep RCL ‏ا‎ ‎Bremer, 2002 ;Tung, 2000 :o355 ۲۱ ‏میتوکندریائی:‎ OO ‏مطالعه‎ .13 ۴ Alonso, 2004 ;Liu, 2003 ;, 2002 

صفحه 85:
4. شناسائی متنیلاسیون: 2001 ,1۳۱06 ااع۲ا۵) ;Lehmann & Kreipe, 2004 ;, 2004 Thomassin, 2004 5. تشخيص غيرفعال شدن زنها در كروموزوم «: ‎van Dijk, 2002 ;Hartshorn, 2002‏ Zhou :WL® sleweSq) 52 ‏تعيين همسانى‎ .6 2004 Gibbs ;Sabek, 2002 :giac rigu wi spy 17 2003 8. پیگیری نتایج, پس از پیوند سلولهای بنیادی ‎;Alizadeh, 2002 ;Elmaagacli, 2002 : jluig>‏ ‎Harries, 2004 ;Thiede, 2004‏ 0 OL eWras Rec Se NCIS SC RC ST ere) :۴۱۳۱۵۵0 1, 2002 ‏پیوند سلولهای بنیادی خونساز:‎ ;Gabert, 2003 ;Sarris, 2002 ;Cilloni, 2002 Van der Velden, 2003 

صفحه 86:
در سايت ‎21111611065161١‏ كيتهاى متعددى براى تشخيص ‎Clee‏ ل ا 2 ا لت 20 / شده است: Acinetobacter baumannii Adenovirus Type B Adenovirus Type C Adenovirus Type F and G Aggregatibacter actinomycetemcomitans Aspergillus all pathogenic subtypes Avian adenovirus: Egg Drop Syndrome Avian influenza: H5N1 Bacteria Hemorrhagic Septicemia Bifidobacterium ۱ efemaneeesd 

صفحه 87:
Enterococcus faecium Enterovirus Escherichia coli Eubacteria Sin Nombre 

صفحه 88:
به طور کلی دو روش برای انجام 0608 کمی با ‎Ce eto een ee‏ 19[ ie 3 1- سنجش غیراختصاصی 2-سنجشر ۳ Gye erent tee eas PP ‏0ك‎ Te Cn CS BBY TEN MP ONO SRO aay . ‏در ادامه توضیح خواهیم داد‎ 

صفحه 89:
‎ee‏ سس اين روش با استفاده عوامل متصل شونده به 00000 مثل. ا ‎i‏ اين رنك از طريق ‏ ‎ ‎ ‎CCC a 

صفحه 90:
1 را 62 1 

صفحه 91:
SYBR® Green | Detection Chemistry High Flexibility and Low Cost ‎Polymerization‏ | سس ‎Denaturation VSS"‏ | ‎A Oe‏ انسست %% @ 9 17 — ‎‘of yy“ ٠‏ ‎| Primer annealing ‎0 ‏حابر‎ : -amm.org.ir : ‎OE ‏ل‎ ‎ 

صفحه 92:
1 مشابه 0 است. 0 ‏ال‎ Cur ply 910 a, DOO 0 ‏ار را‎ ‎CERO‏ 7 ا ا ‎Oren‏ ‏ترييك ‎١‏ افرايت0007هاى دووشتةاى مفدان سابيركرين ‎CRE UCnD Pry‏ 0 ا 00 ‎CSS TCee a | eC perry‏ ا ‎RHE‏ ‎0 Se] ‎ 

صفحه 93:
CMC KCC 

صفحه 94:
‎OTT CIs TANCE Ory)‏ رد ار 3285 مل متصل شونده به 000) نشان داده شده ‎ 

صفحه 95:
از جمله مزایای ۵06 م6۲۹۲ ترسیم منحنی ذوب (40 71 ‎EON Croc‏ ا 00 افك 1 ترسيم و براى تاييد نتايج استفاده مىشود. دماى ذوب ‎a aS cul J9gSg0 wil sly og pio S OOO‏ / ‎era eae fe ees‏ ۳[ غلظت پروب, م دارد. 

صفحه 96:
| 7 ‏ا ا ا‎ cer] Be ‏ذوب هر نمونه را رسم کند. اين کار بوسيلة اندازه‌گیری تغییرات‎ ‏فلورسانس در دماهاى مختلف صورت مىكيرد. مراحل انجام كار‎ 0 0 ‏ا ا ا ا ا ا‎ 0 2 PCC) a7) 94 a ‏ا ا ا ا ا‎ 2d2UW0 ‏سانتیگراد می‌رساند, در این حالت تمام 000)ها به صورت‎ ‏تكرشتهاى هستند و ميزان سايبركرين متصل شده حداقل است.‎ ‏در نتیجه میزان فلورسانس ساطع شده کم می‌باشد. به تدریج‎ 1 ‎were irs. sb‏ و در اين,مدت نوز تتباظم. شنده راز ‎ ‎ ‎fo pare rane’ ee PC toe MO ‏ا ا ال‎ es Perea Rare Ree eRe ‏ام ا‎ ‏می‌گردد. ‎ 

صفحه 97:


صفحه 98:
.amm.orq.ir Lles Wald 51 S52 irio yl 52 caw! POR Jgars S Por این با تحلیل منحنی ذوب می‌توا ار اد ‎Ne‏ را تشخیص داد. نرم‌افزار. سرعت تغییرات را به صور اه( سس مضاء3) 0 در محور ب و دمای دستگاه 0 0 [0 EY IS POCI RC OTST Cr eas مىآيد كه در اين منحنى هر قله نمايانكر يى محصول 50)8) است. قله‌هایی که در دماهای پایین‌تر هستند, نشان دهندة قطعات كوجكتر هستند. 

صفحه 99:
Ge IES PN MPTP RE EEOC) oe | ‏ا ا‎ )000)8 ‏شده (يايينترين قله) نمونه كنترل مىباشد كه فاقد‎ 0 ‏ا ا‎ ihr moer) Eee | who poly, در انتهاى كار دستكاه با استفاده از ۳ ‎Bree‏ ‏منحنى ذوب رسم مى شود كه جند نكته در هنكام تحليل و بررسی نمودار حتما باید در نظر گرفته شود 

صفحه 100:
2 0 ‏ا ا ا ا ا‎ CSerd vi Pty 9 ‏ل ل ا ا‎ veC Sas) 000 ‏ا ا‎ mt ere ts ‏براساس اين منحنى ما مىتوانيم مقدار و اندازة قطعات‎ 30 2 ‏ا ا‎ DUTi ne Tc S) ‏فلورسنت قابل ردیابی کمتر باشد, قلة تشكيل شده‎ 7 ‏ا ا ا‎ 7 مورد اندازه ى قطعات, هرجه قله در دماى يايينترى 

صفحه 101:
2- سنجش اختصاصی: ‎ee aA re‏ ‎OOP RAGS iNet tae 3‏ تقسیم ‏می‌شود. در اين روش از مکانیسم سیستم انتقال انرژی ‎ 

صفحه 102:
يروب و در فاصلة نزديى به هم قرار دارند. نورى ‎PoC) Cs] ota PIES Ra ete‏ تابش ‏(مسنعنی)) می‌شود که این تابش در ناحية تحریک ۰ ۶ ‏ا ا 0 0 ‎BRCM hes erin s wee ‎US s0 glbw usb soi olKiw lowe whl ‎BOECN 6 PC an meme) ‎HERON cr Sam VOEVR CN cca ae] ‏ع‎ ‎ROBT ear vn] ‏ا‎ 0 ‏وان وليك ‎eu‏ 3 ‎127171121 020 ‎i a: JLail edl> 59 Quewher 9 Reporter aS sibs ‎ 

صفحه 103:
1 26 0 ‏ا ااا ا ا‎ wil gull 2 0 ‏ا‎ EONS ference Pte ee iac eh itCte tore es) PPM ‏از‎ ‎Spee ‏ا‎ ‏ا ع‎ cen Se Try) ce ‏ين‎ ‏نوكلئوتيد است.‎ ‏در اين نوع واكنش 0008 برا‎ 000 ‏اد‎ 1007 owe pe ‏ا ل‎ Ree SCs NSTI TSE ere OPEN fern mere ‏ا‎ 9 294n0 Tyl> Quewher juli jl Reporter wu a jai Pose re ‏ا ا‎ prac) SPR ( ca apeectemo Pec \ pl AST Pet erin pe cme) ‏فلورسانس بيشترى تابش شده و توسط دستكا‎ ه ثبت می‌شود. 

صفحه 104:
Pere 0 ‏ا‎ re] ect Mete ms PL YY EP eee OOP ep (ete, fle alee) eee err ‏ا‎ eS | © ‎arate sean‏ مسج[ ‎ ‎ ‎1! ‎www.amm.org.ir 

صفحه 105:


صفحه 106:


صفحه 107:


صفحه 108:


صفحه 109:
RC enced (ae mee eB ا ا ‎EM PRO RCD Uh kU‏ ‎Siar‏ ل 0 0 00 ‎keen)‏ ا ا 7 3020 از اتصال به 000009 به صورت حلقه است كه به آن ا ‎RC‏ 0000 ا ا ل 0 20 ‎as Era‏ ل 0 50 پروب به محل مورد نظر خود. ساختار سح باز شده و ۷۷۷۷۷ + Fluorophore Quercher Molecular Beacon 

صفحه 110:


صفحه 111:
۱ توالى يروب طورى طراحى شده كه مكمل تعدادى ۸ از نوكلئوتيدها بعد از يرايمر ل-دردع*) است. دو ۳ ا ا ا ل ا ‎Sey 2‏ ا ا 000000 انتهاى 5 ساقه به صورت کووالان 2 و انتهای 3 ‎Ur eve OTERO Nh are‏ 5 پروب به صورت اد است, نور ساطع نمی‌شود. یک بلاکر نیز از تکثیر پروب : 9 چرخة بعدی ۵۵<) ی جهت‌گیری ا يك — — انتهای 3 امه" وسوس ۳ en 

صفحه 112:
۶ در طول چرخه‌های 06 همزمان با اتصال پرایمرها, لوب يروب باز شده و به قسمت تكثير شده از جرخة قبل ‎EPID Y er Tae me eT 7)‏ ا ا ا ا 0 51 حادس © نور ساطع مىشود. در مرحلة بعد يروب از ‎Var Berm De UN‏ اا ا 1 ترتيب در هر بدا با افزايش محصول 02008 مقدار فلورسانس نيز افزايش مىيابد. ۱ ‎OU MMU) e SCC MSCS ME‏ 0 لا ا ا ‎PPE Tere‏ 

صفحه 113:


صفحه 114:
GCORPIODG 9 

صفحه 115:
Comparison of Probe Chemistries 

صفحه 116:
Published Referewes Por rvaltiwe POR Guvresvest Ohewisirtes: 0 ee ۰ can دوه ‎we‏ ‏0 و ۳ ا 3 8 ase 0g BBP ‏جوا‎ a ‏اه‎ 

صفحه 117:
ا ل ا ل Fig. 4.2. Representation of Optical Detection System layout. 

صفحه 118:
5101 Limit of -- n 

صفحه 119:
201+ 15 ‏صدووط أكداز‎ 0 ‘i na at each cycle has not yet risen ove ‏یی‎ "Plateau phase | ۳ ‏اعم‎ ‎the ‏و۱ سس میب اس(‎ the ‏موی‎ ‎oP POR product correkier ty the tata spout OP target teehee نس بودد يسفحات دا لح د ب تسا Cyole *PCR is just began e amount of fluorescence has reached a threshold where it is significantly higher than background (usually 10 times the standard deviation of the 

صفحه 120:


صفحه 121:
7 / 2 ‏ب‎ MAM cr OCMC On me a / GTROOORD COROE DEMLOO 

صفحه 122:
2000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 -1000 -2000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 4 cycle PCR Base Line Subtracted RFU 

صفحه 123:
I, 1 | / ۳۱ 5 cycle SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS HA 100000 10000 1000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 3840 4 POR Base Line Subtracted RFU 

صفحه 124:
| 1 2 ‏بو‎ threshold ‏یر‎ a Wily i 1000 A 2 / 5 1004 / & a 10 1 i 1 UNL ۱ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 3840 4 Cycle SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS 1 

صفحه 125:
“3.360 Intercept: 33.319 Y=-3. KOK + 3.319 Inienowns % © Standards copy number’ reference gefié"experimental 9 “cppy number’ reference geng control, +—target gene l¢—intemal control gene actin, GAPDH, RPLPO etc ficent: 1.000. Siope: Correlation © NORTHERN 

صفحه 126:
AACt EFFICIENCY METHOD ®PPROXIM®TMOVO OETLOO 

صفحه 127:
PCR Base Line Subtracted RFU A -500 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 3234 % 38 40.42 44 Cycle 

صفحه 128:
16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 4 

صفحه 129:
A Ct = target - ref A Ct = 9.70 PCR Base Line Subtracted RFU Ct = target - ref ACt=-1.7 PCR Bese Line Suibtracted RFU 

صفحه 130:
استاندارد ‎ae‏ مورد ۹ ‎OLCy‏ رب ‎١‏ 9 ا اك ‎Ore an NOC)‏ ‎ARO Os Por vertaia rbosperd proteias‏ ات ‎fare, PO;‏ 0 0 ‎OM COCR eMC hone)‏ ۱ سس 00 تسس ‎Lael ie a atl‏ ‎vi COC wr OG ROO‏ ‎Se‏ سا ات ‎ ‎Sh ‎ 

صفحه 131:
Red- ainoj 52 pian astllos sly wiipiul wlio ‏ييه‎ ‏ا 0ك‎ ery 9009 CON ee aC OO OSE DI ac ROL aaa O01 Over Buletcer BOI-PRIGD PPOO Ppphoaion Over POOOWT POOOD Cowpenducr ۱ ONCOL az amg os AN AOL CaO MRR KUN para Ora (Oley Cen naa ‏ا‎ Ocal i 13 

صفحه 132:
: مقالات منبع ۱۱۱ ‏ل‎ eae Ps IS) ra ‏رقابتي‎ قدرتا... رحیمی) 2- تاثیر 6 هفته تمرین استقامتي بر تظاهر ژن ۷ كبدي موش ویستاز ۰ ‏كاما‎ de Cte at pene dc ered با استفاده از روش60)8-</8). ‎CRUE RO Laer)‏ ا ا ل ل لك ات ‎eee ei are Tay a Pee rey en ti‏ نا ‏نیمه کمي‌چند گانه (660606) ‎۱ Re ral ee ST SRL Se aE CSE Lerma Len) [1 Sevier rey ery ‎Ce ae ‏ا‎ OL Eee iar eat xe) ‏0ك‎ ken te ‎QOortk Corvtaa Gate Daversiy, Radek, OC, OGB ‎i Ore eee) ay‏ 00:06 ملس ‎۱۹ 

صفحه 133:


In the name of ALLAH Under supervision of Dr.FATHI exercise physiology university of mazandaran ?What genes ژن ها حامل اطالعاتي هستند که تعيين کننده ي ويژگي هاي شما هستند.هر سلو 35000 ل بدن انسان شامل 25000تا ژن است. ژن ها روي کروموزمقرار دارند.کروموزم ها به صورت جفتي هستند و روي يک کروموزم صدها و يا شايد هزاران ژن وجود دارد.ژن ها و کروموزم ها اِز DNAتشکيل شده اند ژن ها و کروموزوم ها: ژنها قطعاتی از یک کروموزوم هستند که اطالعات مورد نیاز برای یک مولکول DNAیا یک پلی پپتید را دارند .عالوه بر ژنها ،انواع مختلفی از توالیهای مختلف تنظیمی در روی کروموزومها وجود دارد که در همانند سازی ،رونویسی و ...شرکت دارند. متابولیزم : DNAسالمت DNAبیشترین اهمیت را برای سلول دارد که آن را می‌توان از پیچیدگی و کثرت سیستم های آنزیمی شرکت کننده در همانند سازی ،ترمیم و نو ترکیبی ، DNAدریافت .همانند سازی DNAبا صحت بسیار باال و در یک دوره زمانی مشخص در طی چرخه سلولی به انجام می رسد. • متابولیزم : RNAرونویسی توسط آنزیم RNAپلیمراز وابسته به DNAکاتالیز می‌شود .رونویسی در چندین فاز ، شامل اتصال RNAپلیمراز به یک جایگاه DNAبه نام پروموتور ،شروع سنتز رونویسی ،طویل سازی و خاتمه ، روی می‌دهد .سه نوع RNAساخته می‌شود. • متابولیزم پروتئین :پروتئینها در یک کمپلکس RNAپروتئینی به نام ریبوزوم ،با یک توالی اسید آمینه‌های خاص در طی ترجمه اطالعات کد شده در RNAپیک ، سنتز می‌گردند. تاریخچه ژنتیک • گریگور مندل در سال 1865قوانین حاکم بر انتقال صفات را کشف کرد. • در سال 1900میالدی کشف مجدد قوانین ارائه شده از سوی مندل ،توسط «درویس»« ،شرماک» و «کورنز» باعث شد که نظریات او مورد توجه و قبول قرار گرفته و مندل به عنوان پدر علم ژنتیک شناخته شود. • در سال 1953با کشف ساختمان جایگاه ژنها ازسوی جیمز واتسن و فرانسیس کریک ،رشته‌ای جدید در علم زیست شناسی به وجود آمد که زیست شناسی ملکولی نام گرفت. تقسیم بندی علم ژنتیکژنتیک مندلی ژنتیک جمعیت ژنتیک م • ژنتیک مندلی یا کروموزومی بخشی از ژنتیک امروزی است که از توارث ژنهای موجود در روی کروموزوم‌ها بحث می‌کند ،اما برعکس در ژنتیک غیر مندلی که به ژنتیک غیر کروموزومی نیز معروف است ،توارث مواد ژنتیکی میتوک موجود در کلروپالست و مورد تجزیه و تحلیل ندری ، قرار می‌گیرد. ولکولی REAL TIME PCR مقدمه به طور طبیعی از تکنیک RT-PCRبرای مشخص نمودن الگوی بیان ژنهای مورد نظر در شرایط متفاوت و همچنین برای تعیین ساختار RNAاستفاده می شود. باید توجه داشت که RT-PCRیک تکنیک پیچیده ای است که کلیه عوامل فیزیکی و شیمیایی دخیل در آن به هم وابسته هستند لذا تکرارپذیری ، حساسیت و ویژگی تست به بهینه سازی تکنیک و برقراری تعادل بین این عوامل بستگی دارد. gene expression در سلول همانند سازی ژن درPCR بيان‍ ژن بیان ژن فرایندی است که در آن اطالعات درون ژن استفاده می شود تا یک محصول کاربردی از آن به دست آید. منظور از بیان ژن یعنی استفاده ازآن ژن به منظور تولید RNAو یا پروتئین است . وقتی ژنی مورد استفاده قرار می گیرد می گویند آن ژن بیان شده و روشن است و وقتی كه یك ژن مورد استفاده قرار نگیرد می گویند ان ژن خاموش است. اینكه در زمان مشخصی كدام ژن روشن و كدام ژن خاموش باشدبه تنظیم بیان ژن معروف است. مثال ساده از تنظيم بيان ژن باكتری E.coliدر دستگاه گوارش مازندگی می كند و منبع انرژی آن قند گلوكز است .در صورت فقدان گلوكز می تواند ازالكتوز (گلوكز+گاالكتوز)نیز برای تأمین انرژی استفاده كند .پس درفقدان گلوكز این باكتری نیاز به آنزیم های جذب و تجزیه الكتوز دارد .بنابراین در صورت وجود گلوكز نیازی به این آنزیم ها نمی باشد و ژن مربوط به آن خاموش است ولی وقتی كه گلوكز در محیط نیست و الكتوز وجود دارد ژن مربوط به جذب و تجزیه الكتوز بیان شده و روشن است. تفاوت تکثیر ژن در سلول و آزمایشگاه • • • • تکثیر ژن در DNAیک بار انجام می شود تکثیر در آزمایشگاه می تواند چندین بار تکرار شود.مثال تکثیر در PCRمی تواند 30تا 35بار تكرار شود. همانندسازی در سلول کل ژن ها را تکثیر می کند در آزمایشگاه می توانیم یک قطعه خاص از DND را تکثیر کنیم(این بخش می تواند یک ژن خاص،اینترون و اگزون باشد). روش هاي اندازه گيري بيان ژن كمي ‏Quantitative دستگاه ريل تايم نيمه كمي ‏semi-quantitative آر(الكتروفورز) دستگاه پي سي :روش اندازه گيري نيمه كمي ‏Polymerase Chain Reaction )واکنشهای زنجیره ای پلیمراز( PCR Introduction to PCR PCR was invented in 1984 by ( Kary mullis ) & he received the N obel Prize in chemistry in 1993, for his invention. • از سال ۱۹۸۰به بعد عمدتا از روش PCR (واکنشهای زنجیره ای پلیمراز) در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود .در این روش با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان فرآیند تکثیر DNAرا بدفعات انجام داد. • امروزه این تکنیک به عنوان یک روش قدرتمند در تشخیص بالینی برای بررسی وجود‌موتاسیون در ژنوم انسانی ،یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژنها و همچنين تعيين غلظت مواد استفاده می شود کاربردهای PCR .i تشخیص بیماریها .iiتحقیقات جنایی .iiiانگشت نگاری ژنتیک .ivبررسی DNAقدیمی .vجداسازی DNAی ژنومی .viتعیین توالی PCR انواع • RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) • Nested-PCR • Multiplex-PCR • ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-PCR) • HDP:helicase dependent pcr RT-PCR )(Reverse Transcriptase-PCR • الگوی اولیه در ،RT-PCRمولکول RNAتک زنجیره ای است .از آنجائیکه DNAپلیمراز قادر به استفاده از RNAبعنوان الگو نمی باشد ،مرحله دیگری به PCRاضافه شده است .طی این مرحله ،با استفاده از آنزیم رورس ترانس کریپتاز ((Reverse Transcriptase ، RTاز الگوی ،RNAمکمل آن )DNA‌C (complementary DNA سنتز می شود و بوسیله تکنیک PCRتکثیر می یابد .بمنظور تعیین گونه و حساسیت دارویی در ویروس شناسی و مایکوباکتریولوژی ،از این روش برای تکثیر RNAریبوزومی استفاده می شود. Nested-PCR • در این روش بمنظور افزایش حساسیت PCRاز دو جفت پرایمر استفاده می شود .ابتدا با یک جفت پرایمر اول در طول 15-30چرخه ،قطعات مشخصی از DNAهدف تکثیر می یابند .سپس محصول PCRحاصل به لوله دیگری منتقل شده و بعنوان الگو استفاده می شود و بوسیله جفت پرایمرهای دوم مرحله دوم PCRانجام می شود. Multiplex-PCR در این روش از چند جفت پرایمر اختصاصی برای هدف های مختلف استفاده می شود .در میکروب شناسی بالینی ،با استفاده از این روش امکان شناسایی چندین عامل بیماری در یک نمونه بطور همزمان وجود دارد و می توان عفونت های مخلوط را تشخیص داد. ARMS-PCR )(Amplification Refractory Mutation System-PCR • روش آرمز _ پی سی آر ( )ARMS-PCRبرای تشخیص موتاسیون های نقطه ای بکار می رود و از دو جفت پرایمر استفاده می شود .در این روش ،واکنش در دو لوله جداگانه انجام می شود که یکی از آنها حاوی پرایمرهای نوع موتاسیون یافته و دیگری حاوی پرایمرهای نوع معمولی است .چنانچه تکثیر در لوله حاوی پرایمر موتاسیون یافته انجام شود ،در DNA هدف ،موتاسیون اتفاق افتاده است و تکثیر در لوله حاوی پرایمر معمولی ،نشان دهنده آن است که موتاسیونی اتفاق نیفتاده است .از این متد می توان در تشخیص موتاسیون های مولد مقاومت دارویی در باکتری‌ها استفاده کرد. HDP:helicase dependent pcr • در این نوع pcrبه جای افزایش دما از هلیکاز برای جداسازی دو رشته DNAاستفاده می شود تخليص :RNA مقدار 50تا 100ميلي گرم از بافت مورد نظر (كبد موش )...را با روش هموژنيزه كردن(با نيتروژن مايع) پودر كرده و با كيت مخصوص RNAتخليص مي گردد .سپس تا زمان استفاده از آن در PCR آن را در يخچال با دماي -70درجه سانتي گراد قرار مي دهيم. *** در استخراج RNAباید از دستکش استفاده کرد.زیرا سلول های مرده پوست RNAseتولید می کنند که باعث تخریب RNAمی شود.از بین بردن RNAse حتی از طریق اتوکالو کردن هم صورت نمی گیرد.پس آب و تمام وسایل باید از RNAseاستریل شوند. برای استریل میکروتیوب ها از ماده ای به نام Depc (دی اتیل پیرو کربوکسیل)استفاده می شود. تذکر:بخارات Depcو تماس آن با پوست به شدت خطرناک و سرطان زاست. تبديل RNAبه cDNA • RNAنمی تواند به عنوان الگو در PCR استفاده شود پس اولین مرحله رونویسی معکوس از روی RNAو تولید cDNAمی باشد .سپس این الگو با PCRبه صورت نمایی تکثیر یافته و میزان آن افزایش می یابد ‏Contaminations like RN As must be ‏removed by RN ase. دالیل تبديل mRNA .به cDNA RNA-1خيلي حساس است(.چون RNAناپایدار است باید به CDNA تبدیل شود) *از میان انواع RNAفقط mRNAبه cDNAتبدیل می شود ‏RNA -2اگر دي فريز شود از بين مي رود. cDNA-3خيلي مقاوم تر از mRNAاست حتي اگر 2روز هم در محيط بيرون يخچال بماند خراب نمي شود. -4آنزيم Taqنمي تواند mRNAرا به صورت الگو قرار دهد لذا نخست توسط آنزيم هاي نسخه بردار معكوس ناشي از ويروس هايي مثل (Mo-MLV )Moloney Murien Leukemia Virus و )AMV(Avian Myleo-blastosis Virus ،مولكول mRNAبه cDNAتبديل مي شود و سپس Pcr معمولي انجام مي شود اجزاي مورد نياز در :Pcr template DNA: DNAی الگو: شامل DNAی هدف است که تکثیر می گردد. پرایمرهای Forwardو :Reverse به گونه ای طراحی شده اند که هر یک مکمل ناحیهَ ۳در یکی از رشته های DNAباشد. یا )Taq polymerase(Thermus aquaticus ‏DNAپلیمراز دیگری که دمای بهینه اش در حدود ۷۰درجه سانتیگراد باشد. )free nucleotides (dNTPs for DNA, NTPs for RNA مصالح ساختمانی که توسط DNAپلیمراز برای ساختن رشته های DNAی جدید بکار میروند. :Bufferمحلول بافر(:کاتیونهای دو ظرفیتی :یونهای شرایط منیزیم یا منگنز) محیطی مناسبی را از نظر pHو یونهای مختلف ایجاد میکند تا پایداری DNAپلیمراز و فعالیت بهینه آن تامین شود. *ویال(میکروتیوپ):لوله های کوچک آزمایشگاهی که نمونه ها در آن قرار می گیرند *سمپلر:وسیله ای برای انتقال محلول به درون ویال مراحل دستگاهPCR :*Initialization stepمرحله شروع به مدت ۱تا ۹دقیقه دمای محلول به ۹۴تا ۹۶درجه (یا ۹۸درجه اگر پلیمرازها کامال به حرارت مقاوم باشند) رسانیده میشود. این مرحله فقط برای DNAپلیمرازهایی ضروری است که نیازمند فعال شدن توسط حرارت در روشhot-start PCR هستند. : Denaturation step )1مرحله واسرشت دما 94:درجه سانتي گراد زمان 30:ثانيه تا يك دقيقه در این مرحله بعلت گسستن پیوندهای هیدروژنی (بین نوکلئوتیدها) DNA ،ی الگو و پرایمرها از هم جدا و تک رشته های DNAحاصل میگردد. میشوند )2 ‏Annealing step:مرحله اتصال دما ۳۰ – ۶۵ :درجه سانتي گراد زمان 30:ثانيه تا يك دقيقه در این مرحله پرایمرها به تک رشته های DNAی الگو متصل می شوند .بطور طبیعی ،دمای اتصال در حدود ۳الی ۵درجه پائین تر از نقطه ذوب پرایمرها است .پیوندهای هیدروژنی پایدار فقط زمانی شکل میگیرد که سکانس پرایمر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند .آنزیم پلیمراز پس از اتصال به هیبرید پرایمر-الگو، همانند سازی DNAرا آغاز میکند. )3 Extension:مرحله طويل شدن دما72 :درجه سانتي گراد زمان 30:ثانيه تا يك دقيقه در این مرحله آنزیم DNAپلیمراز با استفاده از dNTPهای موجود در محلول ،یک رشته DNAی جدید را در جهتَ ۵بهَ ۳و در مقابل رشته های الگو می سازد .در دمای بهینهDNA ، پلیمراز در هر دقیقه ،یک هزار باز را پلیمریزه می نماید. در مرحله طویل شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تامین شرایط بهینه ،مقدار DNAدر محلول PCRدو برابر میشود .بنابر این در هر سیکل ،PCRغلظت DNA بصورت تصاعدی افزایش می یابد. :* Final elongationمرحله طویل شدن نهایی این مرحله ،پس از آخرین سیکل ،PCRبه مدت ۵الی ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰الی ۷۴درجه انجام میشود ،تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNAهمانند سازی شده اند. * : Final holdنگهداری نهایی در این مرحله ،محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵درجه قابل نگهداری است. *الکتروفورز در ژل آگارز: نهایتا میتوان محصوالت PCRرا بر روی ژل آگارز و همراه با مارکر وزن مولکولی( DNA laderکه حاوی قطعات DNAبا اندازه های مشخص است) الکتروفورز نمود ،تا صحت انجام PCRبررسی شود. Animation and video pcr Package بعد از آنکه کار ما با دستگاه pcrانجام شد محصول یا قطعه قابل تکثیر را در ژل آگارز قرار داده وآن را در دستگاه الکتروفورز می گذاریم تا مقدار تکثیر ژن را نسبت به محصول استاندارد یا کنترل٭ (اکثرا بتا اکتین) نشان دهد ٭ کنترل داخلی :به منظور کاهش تفاوتهایی که طی آزمایش بین نمونه های متفاوت به وجود می آید و در حقیقت برای یکسان نمودن نتایج آزمونها و حذف خطاهای آزمایش استفاده از یک کنترل داخلی ناگزیر است .این کنترل یک RNAی درون سلولی است که باید در تمامی سلولهای بافت مورد نظر به طور یکسان ساخته شود .و از طرفی نباید تحت تیمارهای آزمایش تاثیری بر تولید آن ایجاد شود. از آن جمله :ژن گلیسر آلدهید دهیدرژناز ،بتااکتین ،بتا ـ دو میکروگلوبولین ،هیستون ، H3سایکلوفیلین و آلدوالز را می توان نام برد . الكتروفورز DNAروي ژل آگارز الکتروفورزد (به انگلیسی )Electrophoresis :به حرکات ذرات در یک مایع تحت میدان الکتریکی گویند. لغت فورز به معناي حركت و تحرك است و الكتروفورز در واقع حركت ذرات تحت تأثير ميدان الكتريكي را گويند. به سبب اینکه ماکرومولکول‌های زیستی مانند ‌دی‌ان و پروتئین‌ها باردار هستند می‌توان با قرار دادن ی آنها در یک میدان الکتریکی ،آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی ،وزن مولکولی و بار الکتریکی ،تفکیک کرد .برای این منظور از روشی بنام الکتروفورز استفاده می‌شود. نماي ساده از دستگاه الكتروفورز: دستگاه الكتروفورز شامل يك محيط خالء ،يك الكترود منفي و يك الكترود مثبت در دو طرف ذره باردار مي باشد .اسيدهاي نوكلئيك داراي بار الكتريكي هستند .گروه هاي فسفات روي اسيدهاي نوكلئيك داراي بار منفي هستند .بنابراين DNAرشته .داراي بار الكتريكي منفي مي باشد ( DNAدارای شارژ منفی است و برای الکتروفورز شدن باید نمونه بطرف قطب منفی با شد تا هنگام الکترو فورز به سمت قطب مثبت حرکت کند) وقتي كليد باز است يا به عبارتي جريان الكتريكي قطع مي باشد ذره موردنظر در ميدان الكتريكي ثابت است و زماني كه كليد بسته است يا به عبارتي جريان الكتريكي وصل باشد ذره موردنظر به تنهايي و با سرعت شتابدار تا رسيدن به الكترود مثبت حركت كرده و برقراري جريان الكتريكي در تانك الكتروفورز همواره از الكترود منفي به سمت الكترود مثبت است .البته اين مطلب در مورد رشته DNAكه داراي بارالكتريكي منفي است صادق است. تحرك الكتريكي معيار اصلي سنجش در جداسازي مولكول هاست .وجود ضريب اصطكاك fيك عامل مقاوم براي تحرك است .درحالي كه وجود بار باعث زودتر رسيدن ذره به قطب است .هرچه ذره بزرگتر باشد و شكل آن از حالت كروي دور باشد ضريب اصطكاك fبيشتري داشته و تحرك الكتريكي كمتري داراست. درواقع تحرك الكتريكي هر ذره وابسته به شكل و اندازه ذره و بار ذره است و ضريب اصطكاك نيز كميتي است كه ارتباط مستقيم با اندازه و شكل ذرات دارد هرچه ذره به شكل كروي نزديكتر باشد ضريب اصطكاك كمتري دارند. سیستم های آنالیز نهایی محصول برای تعیین میزان محصول PCRو تفکیک دو قطعه از هم تکنیکهای متفاوتی استفاده می شود .یکسری از روشها بر اساس نشاندارکردن قطعات با پرب های رادیواکتیو کار می کند و روشهای دیگر براساس ELISAاست که حساسیت باالیی را دارند. نرم افزارهای باند دنسیتومتری امکان آنرا ایجاد کرده اند که با اندازه گیری چگالی تراکم باند DNAبر روی ژل آگارز رنگ آمیزی شده با اتیدیوم برماید محصول PCRرا به صورت کمی گزارش کنند .گر چه این روش از حساسیت دو روش فوق برخوردار نیست ولی در بسیاری از موارد کاربرد فراگیری دارد . Electrophoresis Equipment Power supply Cover Gel tank Electrical leads  Casting tray Gel combs وسايل موردنياز در الكتروفورز: .1دستكش .2كست ( )castو كمب ()comb ‏Gel casting tray & combs  .3ترازو ()Balance .4سمپلر  .5ماكروويو .6تانك الكتروفورز Power supply .7 (جهت برقراري جريان الكتريكي در تانك الكتروفورز) .8دستگاه عكسبرداري Gel Doc مورد نياز مواد .1پودر آگارز : EtBr .2اتيديوم برمايد (ماده اي بسيار سمي و موتاژن قوي است) ‏TBE 1x .3 ‏Loading Buffer .4 ‏Marker .5 .6آب مقطر :ژل آگارز )1 يك ژل پايدار است و قطر روزنه هاي آن بسيار بزرگ است و براي جداسازي ماكرومولكول ها و سوپر مولكول ها استفاده مي شود .از ژل آگارز در الكتروفورز هم به صورت عمودي و هم به صورت افقي استفاده ميشود .اين ژل را در درصدهاي مختلف تهيه مي كنند كه اين مطلب به اندازه قطعه موردنظر بستگي دارد .يعني هرچه اندازة قطعه موردنظر بزرگتر باشد غلظت ژل كاهش مي يابد و برحسب اندازه قطعه ژل آگارز را در cast 60 تهيه مي كنند. ‏cc, cast 30 cc بطور مثال :براي قطعه اي با ميزان 100 bpاز ژل آگارز %5/2استفاده مي كنيم. كمترين درصد ژل آگارز در حدود %6/0 مي باشد. ):اتيديوم برومايد( Et.Br: شديدًا موتاژن است و بسيار سمي است از تنفس بخارات آن بايد پرهيز نمود و پسمانهاي مرتبط با اين ماده بايد در داخل گالن هايي كه بر سر آنها يك قيف ايمني متصل است دفع شود .فرمول شيميايي اين ماده c21H20Brn3مي باشد .وزن مولكولي اتيديوم برومايد Mw=394/3مي باشد. Loading Buffer : تركيبات اين ماده عبارت است از برموفنل و سوكروز و فرمول شيميايي سوكروز عبارت است از C21H22O11و وزن مولكولي Mw=3/342حركت اين رنگ نشان دهنده حركت محلول آن بوده يعني حركت آن عالوه بر صحت انجام كار يك شاخص براي اندازه گيري و حركت محلول در داخل ژل است . طرز تهيه : Loading Buffer سوكروز %40و برموفنل %25را با يكديگر مخلوط كرده محلول حاصل Loading Bufferنام دارد. TBE : تركيبات اين ماده به قرار زير است .تريسEDTA ، ،بوريك اسيد :روش كار . 1پودر آگارز را وزن كرده و درون بشر يا ارلن بريزيد. TBE lox .2را كه در دسترس است توسط آب مقطر به نسبت 10:1رقيق كرده و بدين طريق TBE lxرا بسازيد. ‏Buffer Solution ‏Agarose  .3كمب ( )Combرا بر روي كست ()Cast موردنظر قرار دهيد و فاصله بين Comb , Castرا 1mmدرنظر گرفته وب راساس اين فاصله جايگاه combبر روي castرا تنظيم كنيد.  TBE lx .4را براساس حجم موردنظر توسط استوانه مدرج داخل ارلن يا بشر ريخته و به آهستگي تكان دهيد. .5محلول داخل ارلن را در داخل ماكروويو قرار داده يا بجوشانيد بطوري كه ذرات ،آگارز داخل آن كامًال حل شده و ذره اي داخل آن نباشد و محلول يكنواخت گردد. و سپس محلول موردنظر را سرد كنيد. .6به محلول درون بشر در حدود ( )1-2mاز اتيديوم برومايد توسط سمپلر اضافه كنيد. .7محلول را تكان دهيد تا اتيديوم برومايد كامًال در آن حل شده و محلول يكنواخت گردد.  .8محلول درون بشر را به آرامي درون cast ريخته و در حدود min20صبر كنيد تا ژل آگارز بسته شود.  .9ژل را به همراه castداخل تانك الكتروفورز قرار دهيد و جاي آن را ثابت كنيد و سپس تانك را تا كمي باالتر از ژل توسط TBE lx پر كنيد. ‏DNA ‏ ‏Anode )(positive ‏ ‏ ‏ ‏wells ‏Cathode )(negative ‏buffer  طريقه ران كردن ()Running Procedure .1به تيوبهاي حاوي نمونه به ازاء هر 5mlاز نمونه موردنظر در حدود 1mlاز Loading Bufferبه آن اضافه كرده و خوب Pipetingكنيد. .2بوسيله سمپلر محتويات درون هر tubeرا داخل چاهك از سمت چپ به راست از ژل runكنيد و در آخرين چاهك نيز ماركر را ران كنيد.  .3جريان الكتريكي در حدود (120 )120v ولت به تانك وصل كنيد تا محلول runشده از چاهكها خارج شود و سپس ولتاژ را پائين آوريد و در ولتاژ حدودًا بين 80تا 90ولت قرار دهيد.  .4پس از حدودًا 45دقيقه ژل را از تانك خارج كنيد و سپس از كست ( )castتير خارج كرده و در داخل دستگاه Gel Docقرار دهيد. پس از قراردادن ژل 5. در داخل دستگاه عكس ژل را بگيريد آماده سازی قالب كار دستگاه ژل داكGel Cod : -1ژل را از كست خارج كرده و داخل دستگاه Gel Docقرار داده و جايگاه ژل را تنظيم كرده و درب دستگاه را ببنديد.  -2مانيتور را روشن كرده و ازطريق مانيتور محل قرارگرفتن ژل را تنظيم كنيد. -3سپس اشعه ( uv)Ultravioletرا روشن كرده تا باندها نمايان شوند. -4با كليد ( )+و ( )-نور را زياد و كم كنيد.  - 5وقتي باندها مشخص شد ابتدا كليد saveرا فشار دهيد و سپس كليد printرا روي دستگاه printingفشار دهيد و عكس ژل را بگيريد. -6سپس uvرا خاموش كرده و تمام دستگاه ها را نيز خاموش كرده و ژل را از دستگاه Gel Docخارج نمائيد. نتيجه گيري: از مقايسه باندها با باندهاي ديگر و همچنين ماركر markerو نمونه normalمي توان تغييرات و موتانتها را تشخيص داد و يا حتي وجود يا عدم وجود DNAرايتر را مشخص كرد .ايجاد باند و تأثير uvروي آن وجود DNAرا ثابت مي كند Animation Electrophoresis Package روش اندازه گیری کمی ‏REAL TIME PCR Real Time PCR مقدمه واکنش های زنجیره ای پلیمراز PCRجایگاه خود را در تاریخ زیست پزشکی بعنوان یک روش انقالبی تثبیت کرده است .تکنیک های متعددی برگرفته از PCRآمده و رفته اند . از زمانی حدود یک دهه قبل ‌،که تکنیک Real Time PCRبر اساس مفاهیم متداول ‌PCRشکل گرفته وشروع به کارنموده است روند رشد وتکامل آن دائم در حال رشد ومورد توجه است . با پرش به مرحله انجام کلیه مراحل PCRدر یک دستگاه وتنها در یک مرحله نسبت به روش سابق که مبتنی بر مراحل بعدی پس از اتمام PCRبود .قدم بزرگی برداشته شد Real Time PCR .به تنهایی حساس ترین وتخصصی ترین روش کمی وکیفی PCRمیباشد. مفهوم Real Time PCRاین است که شما قادر به دیدن نمودار در حین زیاد شدن تعداد کپی های توالی مد نظرتان در طول PCRروی مانیتور کامپیوتر بصورت حقیقتا همزمان Real Time PCRباشید .  Real Time PCRمجموعه تکراری ازسیگنالهای فلورسانت از یک یا چندین واکنش زنجیره ای پلیمراز بصورت همزمان تحت پوشش دامنه ای از سیکلها اند . اندازه گیری کمی ‌،Real Time PCRدرحقیقت تبدیل سیگنال های فلورسانت از هر واکنش به اعداد و ارکان قابل رویت برای هر نمونه است . اندازه گیری کمی PCRبا ایجاد یک توالی DNA مکمل cDMAبوسیله آنزیم Reverse Transcriptase رونویسی کننده معکوس شروع شد .دو نوع آنزیم RTدر بازار موجود هستند AMV :تولید شده توسط پیترز وهمکارانش در سال 2004وآنزیم MMLVتوسط ژرارد وهمکارانش در سال .1997 :Real-time PCR کاربردهای ;Wu, 2007 : تعیین تعداد کپی از هر ژن. • TaqMan® Gene Copy Num sProtocol for 7900HT ; وGiulietti, 2001: سنجش میزان بیان ژن.2 • Leung, 2005 Rajeeva : بررسی صحت نتایج در آرایه ها.3 • ation of Array Results و, 2001n Page by Pf L : مطالعات ایمنی زیستی و پایداری ژنتیک.4 • , 2002 ova  بررسی میزان اثر بخشی داروها و.5 • Br ;Leruez-Ville, 2004 :مانیتورینگ داروها Kogure, ;Burger, 2003 ennan ;, 2003 2004 Real-Time Immuno-PCR انجام تکنیک.6 • ;Barletta, 2004 ;Adler, 2003 :(IPCR) Lind & Kubista, 2005 رسوب کروماتین با استفاده از اتصال آنتی. 7 • Sandov ;Braveman, 2004 :آنتی بادی-ژن Pot ;Iype, 2005 ;Wang, 2004 al ;, 2004 Puppo, 2005 ;,ratz 2005 Men ;Niesters, 2001 : سنجش ویروسها.8 • Espy, 2006 ;, 2003 gell • • • • • • .9شناسائی عوامل پاتوژن شامل: شناسائی Kear ;Kearns, 2001a :CMV ‏Mengelle, ;Kearns, 2002 ;, 2001b ‏ns 2003 ‏Brya تشخیص سریع آلودگی به مننگوکوک: ‏nt, 2004 بررسی حساسیت استرپتوکوکوس پنومونیا به پنی سیلین Kearns, 2002 : شناسائی مایکوباکتریوم توبرکولوزیس و ‏Torres, گونه های مقاوم;Kraus, 2001 : ‏Hazbon, 2004 ;Cleary, 2003 ; 2003 پاتوژن های میکروبی در آبهای محیطی: ‏ulds, 2002 ; Guy, • .10اندازه گیری میزان آسیب به :DNA , 2001 ‏etma • .11سنجش میزان تماس با اشعه ‏Blakely, 20 رادیواکتیو;Blakely, 2001 : ‏Grace, 2003 ;Grace, 02 ; 2002 • . 12بررسی فرآیندهای زیستی در سلولهای زندهBremer, 2002 ;Tung, 2000 : ‏He, 2 • .13مطالعه DNAی میتوکندریائی: ‏Alonso, 2004 ;Liu, 2003 ; 002 ‏Di Cottrell, • .14شناسائی متیالسیون;Trinh, 2001 : ‏Thomassin ;Lehmann & Kreipe, 2004 ; 2004 , 2004 ‏H • . 15تشخیص غیرفعال شدن ژنها در کروموزوم :X ‏van Dijk, 2002 ;, 2002 ‏artsho • .16تعیین همسانی در لوکوسهای Zhou, 200 :HLA 4 • .17پیگیری نتایج پیوند عضوGibbs ;Sabek, 2002 : , 2003 • . 18پیگیری نتایج ،پس از پیوند سلولهای بنیادی ‏T خونساز;Alizadeh, 2002 ;Elmaagacli, 2002 : ‏Harries, 2004 ;, 2004 ‏hiede • . 19پیگیری عوارض باقیمانده ناشی از بیماری ،پس از پیوند سلولهای بنیادی خونسازElmaagacli, 200 : ;Gabert, 2003 ;Sarris, 2 ; 2002 ;Cilloni, 2002 ‏Van der Velden, 2003  کیتهای متعددی برای تشخیصPrimerDesign در سایت به شرح زیر معرفی،real-time PCR عوامل پاتوژن به روش :شده است Acinetobacter baumannii Adenovirus Type B Adenovirus Type C Adenovirus Type F and G Aggregatibacter actinomycetemcomitans Aspergillus all pathogenic subtypes Avian adenovirus: Egg Drop Syndrome Avian influenza: H5N1 Bacteria Hemorrhagic Septicemia Bifidobacterium Bordetella pertussis Enterococcus faecium Enterovirus Human Influenza A virus Escherichia coli Eubacteria Sin Nombre Gardia lamblia Gonorrhoeae Grass Carp Reovirus Haemophilus influenzae And …. به طور کلی دو روش برای انجام PCRکمی با استفاده از Real-Time PCRداریم: -1سنجش غیراختصاصی اختصاصي -2سنجش شامل Hydrolysis Probes : که به سه نوع Taq man، Beacons و Scorpionsتقسیم می‌شود. در ادامه توضيح خواهيم داد . • -1سنجش غیراختصاصی: این روش با استفاده عوامل متصل شونده به DNAمثل SYBR Greenانجام می‌شود .این رنگ از طریق جایگزینی در شیار کوچک DNAبه DNAمتصل می‌شود. ‏SYBR Green از جمله مزایای این روش ارزان ،راحت و حساس ‏TIME ‏REALبزرگ آن این است یکی از معایب بودن آن است. ‏PCR ‌هایی مثل پرایمر دایمر و که با اتصال به دورشتة ‏USING ‏SYBR غلظت بیشتر از دیگر باندهای غیراختصاصی ،نتایج ‏GREEN اصلی برآورد می‌شود و بنابراین بهینه کردن آن باید به صورتی باشد که کمترین مقدار پرایمر دایمر و محصول غیراختصاصی ایجاد گردد. به همین دلیل به این نوع از PCRواکنش غیراختصاصی می‌گویند. بعضي از مراحلي كه در دستگاه RT-PCRرخ مي دهد مشابه PCRاست. اساليد باال نشان می‌دهد در واکنش RT-PCRهنگامی که DNAبه صورت واسرشت ( )Denaturateدر می‌آید، سایبرگرین به DNAمتصل نمی‌شود ،اما در مرحلة Annealingو تکثیر ، DNAهمزمان با دورشته‌ای شدن DNAسایبرگرین در ساختار آن قرار می‌گیرد .به این ترتیب با افزایش DNAهای دورشته‌ای مقدار سایبرگرین متصل شده نیز افزایش می‌یابد و درنتیجه نور فلورسانت بیشتری ساطع می‌شود که شدت نور توسط دستگاه قابل اندازه‌ گیری است. SYBR Green Assay SYBR Green SYBR Green SYBR Green (high fluorescent conformation) SYBR Green SYBR SYBR Green SYBR GreenGreen در شکل زیر نیز مکانیسم عمل سایبرگرین به عنوان یک عامل متصل شونده به DNAنشان داده شده است: از جمله مزایای Real-Time PCRترسیم منحنی ذوب (Melt )Curve Analysisاست که پس از اتمام فرآیند PCR ترسیم و برای تایید نتایج استفاده می‌شود .دمای ذوب DNAیک پارامتر ویژه برای این مولکول است که به ساختمان آن و عواملی نظیر طول و تعداد نوکلئوتید، غلظت پروب ،میزان نمک محیط و درصد GC؟ بستگی دارد. بعد از اینکه RT-PCRبه پایان رسید ،دستگاه قادر است نمودار ذوب هر نمونه را رسم کند .این کار بوسیلة اندازه‌گیری تغییرات فلورسانس در دماهای مختلف صورت می‌گیرد .مراحل انجام کار به این ترتیب است که برای رسم منحنی ،دستگاه دمای نمونه‌ها را در فواصل زمانی مشخص (مثال هر 10ثانیه) به مقدار معینی تغییر می‌دهد .یعنی ابتدا دستگاه دمای نمونه‌ها را مثال به 94درجه سانتیگراد می‌رساند ،در این حالت تمام ‏DNAها به صورت تک‌رشته‌ای هستند و میزان سایبرگرین متصل شده حداقل است .در نتیجه میزان فلورسانس ساطع شده کم می‌باشد .به تدریج دستگاه دمای نمونه‌ها را 5/0درجه سانتیگراد کاهش داده و 10ثانیه در آن دما ثابت می‌ماند و در این مدت نور ساطع شده از نمونه‌ها را اندازه‌گیری می‌کند. همزمان با این عمل منحنی تغییرات فلورسانس بر حسب دما - که همان منحنی ذوب است -ترسیم می‌گردد. در این منحنی هر یک از قله‌ها نمایانگر Tmیک محصول PCRاست .بنابر این با تحلیل منحنی ذوب می‌توان وجود باندهای غیراختصاصی و دایمر پرایمر را تشخیص داد. نرم‌افزار ،سرعت تغییرات را به صورت ‏Relative Fluorescence Unite RFUدر محور yو دمای دستگاه را در محور xنشان می‌دهد. یا پس از مشتق‌گیری از نمودار مقابل ،منحنی درجه دومی بدست می‌آید که در این منحنی هر قله نمایانگر یک محصول PCR است .قله‌هایی که در دماهای پایین‌تر هستند ،نشان دهندة قطعات کوچکتر هستند. در منحنی ذوب فوق همة نمونه‌ها بوسیلة یک جفت پرایمر یکسان تکثیر شده‌اند .نمونه‌ای که با خط قرمز مشخص شده (پایین‌ترین قله) نمونه کنترل می‌باشد که فاقد DNA الگو است و Tmپایین این نمونه نشانگر وجود دایمر پرایمر می‌باشد. در انتهای کار دستگاه با استفاده از پروب TaqManنمودار منحنی ذوب رسم می‌شود که چند نکته در هنگام تحلیل و بررسی نمودار حتما باید در نظر گرفته شود همانطور که گفته شد ،دستگاه بعد از پایان کار منحنی ذوب را ترسیم می‌کند که محور افقی این منحنی دما و محور عمودی آن میزان فلورسنت قابل ردیابی می‌باشد و براساس این منحنی ما می‌توانیم مقدار و اندازة قطعات تکثیر شده را بسنجیم .به این صورت که هرچه میزان فلورسنت قابل ردیابی کمتر باشد ،قلة تشکیل شده کوتاه‌تر است و بنابراین میزان تکثیر آن قطعه هم کمتر بوده که سایبرگرین کمتری به آن متصل شده است .اما در مورد اندازه ی قطعات ،هرچه قله در دمای پایین‌تری تشکیل شود Tm ،قطعه کمتر بوده و معموال باند غیراختصاصی ما در این محدوده قرار می‌گیرد .نمودارهای زیر این مطلب را به خوبی روشن می‌کنند: • -2سنجش اختصاصی: الف: Hydrolysis Probe Technique - این نوع از واکنش Real-Timeبه 3دسته تقسیم می‌شود .در این روش از مکانیسم سیستم انتقال انرژی فلورسانس یا (FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer استفاده می‌شود در این مجموعه پروب‌ها طوری طراحی می‌شوند که در ابتدای پروب یک رنگ فلورسانس به نام Reporterو در انتهای آن فلورسانس دیگری به نام Quencherقرار می‌گیرد. وقتی که Reporterو Quencherدر حالت اتصال به پروب و در فاصلة نزدیک به هم قرار دارند ،نوری که به Reporterمی‌خورد ،باعث ایجاد یک تابش ( )Emissionمی‌شود که این تابش در ناحیة تحریک Quencherاست ،بنابراین Quencherاین نور را جذب کرده و تابشی در طول موج بلندتر که قابل ارزیابی توسط دستگاه نمی‌باشد ،ساطع می‌کند. اما پس از جدایی Reporterاز Quencherنور ساطع شده از Reporterتوسط Quencherقابل جذب نیست و توسط دستگاه به صورت فلورسانس قابل اندازه‌گیری است. ‏Reporter ‏Quencher روش Taq Man Probe: اساس این روش خاصیت Exonuclease ´5آنزیم Taq DNA Polymeraseمی‌باشد .در پروب Taq Manیک Reporterدر انتهای ´ 5و یک Quencherدر انتهای ´ 3وجود دارد .همچنین در انتهای ´ 3یک مسدود کننده ( )blockerهم وجود دارد ،تا پروب به عنوان پرایمر استفاده نشود .پروب حدود چند باز بعد از انتهای ´ 3پرایمر روبه‌جلو قرار می‌گیرد و طول آن 20-30نوکلئوتید است. در این نوع واکنش PCRبرایس اتصال کامل پروب ،به غلظت بیشتری از MgCl2نیاز است. آنزیم پس از نزدیک شدن به پروب با استفاده از خاصیت اگزونوکلئازی ´ 5خود ،پروب را لیز می‌کند و وقتی پروب تجزیه شد Reporter ،از تاثیر Quencherخارج می‌شود و فلورسانس تابش شده از آن توسط Quencherقابل جذب نیست .بنابراین در هر دوره با آزاد شدن بیشتر Reporterماده فلورسانس بیشتری تابش شده و توسط دستگاه ثبت می‌شود. نمودار زیر نشان می‌دهد که میزان افزایش فلورسانس Reporterبا میزان محصول تولید شده ارتباط مستقسم دارد. در هر دوره با آزاد شدن بیشتر ، Reporterماده فلورسانس بیشتری تابش ساطع شده و توسط دستگاه ثبت می‌شود. TaqMan Chemistry R Q TaqMan Chemistry R R R R R R R Q TaqMan Chemistry R Q TaqMan Chemistry R R Q روش :Beacones Probe این پروب نیز همانند پروب Taq Manدارای رنگ در انتهای 3′ و 5′می‌باشد ،اما برخالف Taq Manتجزیه نمی‌شود و در سیکل‌های بعدی دوباره استفاده می‌شود .این پروب قبل از اتصال به DNAبه صورت حلقه است که به آن Stemloop structureمی‌گویند. به علت نزدیکی Reporterو Quencherنور ساطع شده از Reporterتوسط Quencherمهار می‌شود .پس از اتصال پروب به محل مورد نظر خود ،ساختار Stemloopباز شده و در نتیجه رنگ‌ها از هم دور می‌شوند و تابش نور از Reporterانجام می‌گیرد. Molecular Beacons R RR R R R R Q Q QQ Q Q Q روش Scorpion Primers: توالی پروب طوری طراحی شده که مکمل تعدادی از نوکلئوتیدها بعد از پرایمر Forwardاست .دو طرف پروب شامل توالی شش نوکلئوتیدی است که در دمای محیط ایجاد duplexمی‌کند .انتهای 5′ ساقه به صورت کوواالن به Reporterو انتهای 3′ به Quencherمتصل می‌باشد .هنگامی که پروب به صورت duplexاست ،نور ساطع نمی‌شود .یک بالکر نیز از تکثیر پروب توسط پرایمر Reverseدر چرخة بعدی PCRجلوگیری می‌کند .جهت‌گیری پروب به صورتی است که انتهای 5′آن مکمل انتهای Target 3′می‌باشد. • در طول چرخه‌های PCRهمزمان با اتصال پرایمرها‌،لوپ پروب باز شده و به قسمت تکثیر شده از چرخة قبل متصل می‌شود و در نتیجه به علت جدا شدن Reporterاز Quencherنور ساطع می‌شود .در مرحلة بعد پروب از Tamplateجدا شده و به حالت خاموش در می‌آید .به این ترتیب در هر annealingبا افزایش محصول PCRمقدار فلورسانس نیز افزایش می‌یابد. • شکل زیر اجزای تشکیل دهندة پرایمر scorpionرا نشان می دهد ،همزمان با اتصال پرایمرها ،لوپ پروب باز شده و به قسمت تکثیر شده از چرخه ی قبل متصل می‌شود و در نتیجه به علت جدا شدن Reporterاز Quencherنور ساطع می‌شود. SCORPIONS R Q SCORPIONS R Q Q Q R Q Q Q RQ R Q R R R R R R R Comparison of Probe Chemistries Taqma n Beaco n Scorpio n Pu b l i sh ed Referen ces fo r real -t i me PCR Fl u o rescen t Ch emi st ri es 180 160 140 No . o f referen ces 120 Ta qman SYBR Green molecular beacons scorpions 100 80 60 40 20 0 1994 1995 1996 1997 Ye ar 1998 1999 2000 2001 Optical Detection System of Real-Time PCR 1. halogen tungsten lamp 5. 3. detect intensifier 2b. emission filters 2a. excitation filters or 350,0 00 pixels 4. sample plate www.biorad.com [DNA ] Quantitative PCR Threshold Limit of detectio n Ct Cycle # Linear ground phase: •PCR is just began •Fluorescence emission at each cycle has not yet risen above background •Baseline fluorescence is calculated at this time CT - threshold cycle: •the first significant increase in the amoun of PCR product correlates to the initial amount of target template •CT represents the starting copy no. in the original template PCR can be broken into 4 major phases Early exponential phase: •PCR is just began •The amount of fluorescence has reached a threshold where it is significantly higher than background (usually 10 times the standard deviation of the 3-Types of Real Time PCR Quantification STANDARD CURVE METHOD SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS threshold Ct SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS ‘copy number’ reference gene experimental Dilution curve reference ge ‘copy number’ reference gene control Ct EFFICIENCY METHOD APPROXIMATION METHOD control  Ct = target - ref RPLP0 con  Ct = 9.70 IL1-b con av =19.93 av =29.63  Ct = target - ref experimentIL1-b vit  Ct = -1.7 RPLP0 vit av =18.03 av =19.80 Difference = Ct-Ct = Ct = 9.70-(-1.7) = 11.40 RT_PCR استاندارد هاي مورد سنجش در (Housekeeping Gene for Normalization) Commonly used standards: i. ii. iii. iv. v. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase mRNA Beta-actin mRNA MHC I (major histocompatability complex I) mRNA Cyclophilin mRNA mRNAs for certain ribosomal proteins i. vi. E.g. RPLP0 (ribosomal protein, large, P0; also known as 36B4, P0, L10E, RPPO, PRLP0, 60S acidic ribosomal protein P0, ribosomal protein L10, Arbp or acidic ribosomal phosphoprotein P0) 28S or 18S rRNA  The perfect standard does not exist Real- منابع اینترنتی برای مطالعه بیشتر در زمینه Time PCR 1st International qPCR Symposium & Application Workshop, qPCR 2009 ABgene Dual Labeled Probe Design Guide ABI TaqMan Human Endogenous Control Plate ABI User Bulletins ABI-PRISM 7700 Application Notes 7900HT 7000 Compendium AlleleID Pathogen Detection Primer & Probe Design Tool by Premier Biosoft International Ambion TechNotes on Real-Time PCR Applied Biosystems Sequence Detection Systems Automated PubMed Search for Real-Time PCR Available Real-Time PCR Platforms BioCompare BestKeeper© for determination of stable housekeeping genes, Download  :مقاالت منبع استفاده از روش پي -سي -آر معكوس (CRT-PCR) 1-در اندازه گيري بيان ژن رقابتي قدرت ا… رحيمي(( -2تاثير 6هفته تمرين استقامتي بر تظاهر ژن abca1كبدي موش ويستاز بهزاد مهدي خبازيان-دكتر عباس قنبري نياكي-دكتر فاطمه رهبري زاده –دكتر سيد جباري نوقاني حسيني اينترفرون گاما كاخك-مهديmRNA ميزان بيان3- عليرضاكمي تعيين نيمه با استفاده از روش RT-PCR دكتر جليل توكل افشاري* ،عليرضا زماني** ،دكتر جواد بهروان*** ،دكتر **** بهروز شيشه ئيان *****تبيتا سيفي شناسايي ريزحذف هاي q 4-11.2با روش PCR 22 نيمه كمي چند گانه )(SQMPCR سارا پورانوري ،1مهرداد نوروز ينيا* ،2عل ياكبر زينالو ،3سعيدرضا غفاري ،4 مسعود هوشمند ،5سعيد كاوياني ‏Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR ‏Rui Shi and Vincent L. Chiang ‏North Carolina State University, Raleigh, NC, USA ‏BioTechniques 39:519-525 (October 2005)doi 10.2144/000112010 Thank U 4 Leiseing