اندازه گیری هموگلوبین A2

صفحه 1:


صفحه 2:
اليك زربي ge yh 

صفحه 3:
يكي از تست هاي تشخيصي مهم جهت تأئید وجود بتا تالاسمي مینور تعیین درصد هموگلوبین,9) مي باشد . روش پيشنهادي با استفاده از کروماتوگرافي تعویض 2 ‎Dir‏ ‎cokers‏ است. کروماتوگرافي تعویض يوني از انواع كروماتوگرافي هاي مایع - جامد بوده که بر اساس واکنش متقابل گروههاي کر مولکول هموگلوبین و رزین ۰ جداسازي صورت مي گیرد. بر روي رزین يونهايي وجود دارد که قابل تعویض با يونهاي همبار خود در همولیزات مي باشند. در این روش از رزین آنيونيك دي اتیل امینواتیل سلولز 0009)68) استفاده می شود 

صفحه 4:


صفحه 5:
رزین انیونیک 299 تمایل به گرفتن بار منفی دارد . ,۳1۷) بافر ورزین پاین تر از we ‏هموگلوبین‎ lP ‏بايممثبت‎ PW ol 3 PC ‏پیدا می کند . به صورت حلقه‎ ‏جدا میشود‎ @ 66 با" 

صفحه 6:
اساس روش: 0. تورم رزین با بافر و به تعادل رسیدن آن با بافر تا 1041 رزین به رلا) بافر برسد ‎OC‏ اضافه نمودن همولیزات به ستون 9. جداسازي انتخابي اجراي نمونه بوسیله تغییر ,۳ یا قدرت يونيك بافر ‎EA)‏ ** در اندازه گيري هموگلوبین 96) به روش کروماتوگرافي ستوني مي توان از بافر گلایسین یا بافر تریس استفاده 3 1 

صفحه 7:
* رعایت نکات زیر در هنگام اندازه گيري هموگلوبین 96) توصیه مي گردد : ۰ 0 در صورتي که ژل داخل ستونها تغییر رنگ داده باشند نباید مورد استفاده قرار گیرند 2 قبل از استفاده ازستونها و بافر باید حتما" به دماي اتاق برسند. 9 بهتر است از پي پت پاستور تمیز و یا سمپلربا نوك نو جهت مخلوط نمودن رزین داخل ستونها با بافر و حل شدن حبابهای هواي داخل رزین استفاده نمود. <- ستونها ‎low rote hj) ub‏ مناسب برخوردار باشند ‎doin O-COwVkour‏ 

صفحه 8:
6 قبل از تهيه هموليزات بايد نمونه خون تام كاملا" مخلوط شود ©-يس ازتهيه هموليزات بهتراست سريعتركروماتوكرافي انجام شود ( يس از ليز كامل كلبول هاي قرمز ) م قبل از نمونه ككذاري به هيج وجه نبايد رزين خشك شود. به محض اينكه محلول رويى رزين خارج شد بايد هموليزات به ستون اضافه شود. ©از سميلر كالبيره بايد جهت برداشت اشت نمونه خونء بافرو هموليزات استفاده نمود. 

صفحه 9:
باید از لوله های مدرج استاندارد جهت جمع اوری هموگلوبین 96) از ستون و تهیه لوله توتال استفاده نمود.در صورت عدم دسترسی به لوله های فوق لوله های معمولی را به روش دستی (قلم الماس ماژیک) مدرج نمانید. 0- افزودن همولیزات باید به آرامي و درست در سطح رزين صورت كيرد و سطح آن نباید در هنگام نمونه گذاري آسیب ببیند. 0»- بهتراست از يك نوك سمپلر جهت ریختن همولیزات بداخل ستون و لوله توتال استفاده شود . 

صفحه 10:
- به محض جذب شدن همولیزات برروی رزین بایدبلافاصله بافر اضافه شود 9- اگر قبل از جذب کامل همولیزات برروی رزین» محلول بافر ريخته شود باعث كاهش كاذب هموگلوبین 90) مي گردد. <6- باید دقت شود تمامي بافر اضافه شده از ستون خارج شود. ©0- قبل از خواندن جذب نوري » بايد لوله ©0) و توتال كاملا" مخلوط شوند. 

صفحه 11:
9 باید از يك اسپکتروفتومتر کالیبره جهت خواندن جذب نوري لوله ها استفاده شود. ۵ بهتر است از نمونه کنترل صحت تجاري در هر سرى كاري استفاده شود در صورت عدم دسترسي يك نمونه كه هموگلوبین ©0 آن مشخص شده است به عنوان نمونه كنترل گذاشته شود. 

صفحه 12:
- این متد برای اندازه گیری هموگلوبین ‎DE‏ اختصاصی نیست بطوری که بسیاری از هموگلوبین های همبار با هموگلوبین نیز از ستون خارج می شوندکه شامل هموگلوبین )6,6,6 طاسب و بعضی از واریانت های هموگلوبین (0()) 90و زنجیره دلتا میباشند. لذا هموگلوبین 96)از این هموگلوبین ها قابل تفکیک نیست - در مواردی که هموگلوبین 96) بیشتر از 9072 می باشد باید به وجود هموگلوبین های واسب (),(6,() شک نمودکه همراه با هموگلوبین 96)از ستون خارج می شوند.در اين مورد نیاز به بررسی تکمیلی نظیر الکتروفورز هموگلوبین در <۳,260.6)و ۳/۱۷/26-9) و بررسی فامیلی می باشد. - اگر همه همولیزات اضافه شده یکباره از ستون پایین آید .باید به وجود سایر هموگلوبینوپاتی ها شک نمود. بیمار هموگلوبین 9) یا 0و ظ و یا هموگلوبین 02,0 دارد. - اندازه گیری هموگلوبین 6)به روش کروماتوگرافی ستونی نباید در بیمارانی که اخیرا خون دریافت کرده اند صورت گیرد. 

صفحه 13:
- وجود هموكلوبين 4096 تهانی بسیار - موارد تادر موتاسيونهاى 8] لاسمی سفت 8 تالاسمى- هموكلوبين تابايدار - صفت فموكلوبين 9- آنمى داسي شكل- آنمى مكالوبلاستيى GSS aa ‏زتجیرهدلت( 6 )با صفت 8 تالاسمی‎ cle Cal ‏همراهی‎ - - ثاثير متقابل تالاسمی0 و 8 EER a ct - حضور هموگلوبین ۵) (در این مورد صحت اندژه گیری همرگلوبین )کل می شود) - ثاثير متقابل تالاسمي0 و هموكلونين 9 - خطاهاى آتاليتيكال (أزمايش بايد تكرار شود) دي - دلتا بتا( 8 >)تالاسمى(اكر هموكلوبين *0 بالا باشد). - موارد نادر صفت 6 تالاسمى(شامل همراه شدن 8 با دلثا تالاسمى و © 89] تالاسمى) سنت ##الاسين - دلتا بتا ( 8 ؟)تالاسمى(اكر هموكلوبين *0) بالا باشد) ‎ei ok‏ - بیماری هموگلوبین با" - حضور واريانت هاى زنجيره دامنه مرجع 96 37-34 

صفحه 14:
© BD kdl. Dik Dorel WLC: (Wetervaxpies wik D. BC BDkd. (ype) ALOE W Aedes O.or |(stect BD. ) O- BP kd +Oeta Thal. ‏رم‎ ‎eds]. LBC O, WHET © Drnbk Weirv. Por a & BM. MCO O., DOW Jor border lice, Wb BS ‏امه‎ 3 © ‎Erp‏ 000006 حر 

صفحه 15:


صفحه 16:
.PLEGLIDE GLE * @riaiple: Cleviropkoresis is the wovewedt of charged particles witic oc electicd Piekls.Pt PW ©. Whs ue vexively ‏وه لوط‎ urd * Gupportay Deda : Orhibsr (Prete vehiosr) Bel(ajarver ۱۳ ‏مس‎ starch) * @awpe! Wewoboue (bC0-O0ql) * @qupwedt! Chowber,Power Supply,Cetuvse OverteOeduc,pplicain- * ‏هم‎ ‎4- ‏و6۴‎ ۳۵ pl) 0.6 

صفحه 17:
‎ww spevPic— Powe &‏ موه ناملس موی ‎Gpevitic‏ ‎Youvetic acid‏ © ج ود و و اوج (1)- 9 ‎Ortho!‏ وص امسلرواج (1)- وجا 0)- 

صفحه 18:
(Brrors Cloudy or vod. @uPPer @PPers oP teoproper PW or tose sircocty pape ‏حول هرا‎ Bond tras Lb W (leu. Opebperoxtker) Cho Lb band @urdd io Wh @ 

صفحه 19:
de 02,0,6,0 Lepore,5,0,6 e © یناه 

صفحه 20:


صفحه 21:
urd Ontode al a” e 6 Co soir 06 60 Orns: 6 4 ‏ری‎ ‎cunt Oude | ۹ 0 60 ox Go, ‏یه‎ ‎۳ 1 ۳0 ‏طلسم‎ 7 

صفحه 22:
۰ Cotioa Cxckoage Chorowatryraphy toterchooge oP charge ‏دوه معا مه و‎ ‏نون‎ (cequively ‏ده کر ( ده موه‎ orcuy va Wh (positively charge)olerule. ۰ Odvectages? -Buouted ~Ocrry sul sawple ore oP Pi -Quocificaion oP O.&Our. Wb oe ‏ارام‎ 

صفحه 23:
© Oisedvootage: ‏مهو‎ ‏اه عون ویو ولاو-ون-‎ WLC Osxnly seporses WbO,0C,/P,6,C,0,&6 Prow euck ‏اه‎ ‎Wb 6 &bepore ov-ehite wit Wb ۰ 

صفحه 24:
NORMAL HAEMOGLOBINS AND THALASSAEMIA 5 Buffer A Buffer B 1 Sample injection 2 Pump A + Pump B ‏لوم | باه اس]‎ Detector |» o waste ---> Signal > Sample —> Fluid Integrater ¥ Computer 12.6 Diagramatic representation of HPLC showing the flow of sample and buffers. Fig. 

صفحه 25:
5 ۲ له م ‎Aen‏ مبمبس يس حي ۳۳ علسلا عل اط زاغ 4 4 ‎٠١‏ Fig. 12.7 A mixture of ‏وا ره وم‎ HPLC, 

صفحه 26:
GO1IMEGLIODEG FOR 0b «Bah OHO REE WL . wo - @eec- 65 0 - جص الاصطاص (). <00-06. 0 :صصح 3) حاصد2)) خام محر ‎Potd‏ ‎ta Raagyes-‏ و عصاه) اه لاس6 سیجه؟) ان 0.99006 - 98:0.960-00:496) -96 ۰,۶ 8۹۵-۵ :902:9) عبحص نام ۳ ] Ode vut side vP reportable range should aot report CBP less than 1.6 Yr levs tho 1% qreder thor 1d.P% 110.6% 

صفحه 27:
زرا WhPHO.S%, Wh way chute it LOdc/C Wb or - Bde widow ord ‏جد‎ Wb C wil report WbOds 216.8% should be tested Por possible oP - Wb Orica ioterPereure Wh BC>dO % should be tested Por possible- presewe oF Wb Our. Wh O &Wb G we ovehte wit Wh BS Wb © sawples wuy yeurrute vary vver in the- subsequent itjevtiod 

صفحه 28:
© deqreedaicg peuks wap ooehate wits the WbOO =i peul whe suvples poutuics Wh G whick kove ut beru stored uppropriaiey review WhOC peak shape Por ul Wb G sucvplesbePore report © deyradativg peaks wuy ioterPere with the - 8 weuurewed WbOs whe sawples poutcics ‏ظ) عون‎ 6۶ have ut boro stored uppropriviel . do wt report (de result Poo ves peok is ‏حور نامع‎ Pdr& PO Guevples wits Wb vadeds should be checked - Por Wb BC&OUc peak shope 

صفحه 29:
‘Dpicdl @-Deta trol Gace ‏مج ساسا ی‎ WLBECrID% (ALLE) 

صفحه 30:
HbF: 1.0%; HbA: 38.7%; HbA,: 4.4%; HbS: 565 POSITIVE; Peripheral smear with 2+ sickle cells 

صفحه 31:
CGohubiliy test * Gickiog Wb, ia deoxpyecated state (dihivcite OusS,O0g) if teovluble & Porxes uo previpitite ot high wotadpy Pkosphote buPPer ٠ Dest wt spevitic Por Wb G,Report ‘Pos or Ory . Pos test did ont distpuisk Wh OGC,GG, G/B+ .... * Garople: whole blood packed cell ٠ Couch Pos. Control Pbout QO-FG% Wh 6 

صفحه 32:
Gource oP error ام حول نی و شوم[ ‎result Puewin,ichaa<O woutks, resect‏ ری عطه۳) ۷ ‎eoproper Deww.oP Reagecits‏ ‎eoproper wixtay oP the spevies wit Reagect‏ ‎oproper inter pretaiva oF the ne der sve‏ ‎Pose Posuive resultpersves wily‏ بل - ‎Reo cco‏ ‎Wh (oPter spleeueviowy ,Weinz body‏ 

صفحه 33:


صفحه 34:
٠ ‏نمی اس لزق‎ — de sickle vell trait, ‏تحص را یو رادم‎ oP 9S ty FS% vF total Wewodiobia berause the Wb kos u slower rote ‏ابا ما ارو اه‎ ° AP WEG is less thot OO%, start thiahiag about G-clpho- ‏تسا‎ 2 AP WEG ts yredter thor SO%, worry bout G-Beta- thofassewwia or Gichte vel ‏موه کش موه‎ 

صفحه 35:
Expected ratios Wh OG Wh GG 6-0-4 وراه وی ‎Wh G- B thd‏ Wh G- B thd wir WhO SS- 60 eo 0 200 واه 0 9 90- 9S es 90- 9S ©00- 2) Whe a> 9-00 a> 9-00 9-00 

صفحه 36:
۴ بابرا" uholooe ‏همع‎ (bethhe) Wb C-FO% Ookawa chroowutoyrupy WP >PO% Ieowuwloyicd wethods ‏ذا با‎ >29 Wh WICO —OwW Wb desaturation ‏وتان مایت‎ (stop svluica ,| PW previpitates the decature Wh) Pitered> Wh @ weosured ot SEO wv 

صفحه 37:
٠ DiPereue ‏اه‎ duplicate: O0.S%— WbhP ۵ 1% ‏ب‎ Wh 5-0 C% > Wh ۸۵ Arc cowecteraica oP Ow W 8. ‏دس حصو ة)‎ sulPate svbutice ane oritical 

صفحه 38:


• يكي از تست هاي تشخيصي مهم جهت تأئيد وجود بتا تاالسمي مينور تعيين درصد هموگلوبين A2مي باشد .روش پيشنهادي با استفاده از كروماتوگرافي تعويض يونيMicro columnاست .كروماتوگرافي تعويض يوني از انواع كروماتوگرافي هاي مايع – جامد بوده كه بر اساس واكنش متقابل گروههاي باردار مولكول هموگلوبين و رزين ، جداسازي صورت مي گيرد .بر روي رزين يونهايي وجود دارد كه قابل تعويض با يونهاي همبار خود در هموليزات مي باشند .در اين روش از رزين آنيونيك دي اتيل امينواتيل سلولز DEAE52استفاده می شود اندازه گيري هموگلوبين - - - - ‏buffer - - - - ‏resin - - -- - ‏filter همولیزات رزین انیونیک DE52تمایل به گرفتن بار منفی دارد PH . بافر ورزین پاین تر از ‏A2 ‏IPهموگلوبین A2در این PHبار مثبت به صورت حلقه پیدا می کند جدا میشود ‏Hb A - - - ‏Hb ‏A2 + - - - - - - + - - - - + - - - ‏Hb A2 - اساس روش: .1تورم رزين با بافر و به تعادل رسيدن آن با بافر تا PH رزين به PHبافر برسد .2اضافه نمودن هموليزات به ستون .3جداسازي انتخابي اجراي نمونه بوسيله تغيير PHیا قدرت يونيك بافر ** در اندازه گيري هموگلوبين A2به روش كروماتوگرافي ستوني مي توان از بافر گالیسين يا بافر تريس استفاده نمود. * رعايت نكات زير در هنگام اندازه گيري هموگلوبين A2توصيه مي گردد : • • • • - 1در صورتي كه ژل داخل ستونها تغيير رنگ داده باشند نبايد مورد استفاده قرار گيرند - 2قبل از استفاده ازستونها و بافر بايد حتما" به دماي اتاق برسند. - 3بهتر است از پي پت پاستور تميز و يا سمپلربا نوك نو جهت مخلوط نمودن رزين داخل ستونها با بافر و حل شدن حبابهای هواي داخل رزين استفاده نمود. -4ستونها بايد از يك Flow rateمناسب برخوردار باشند 1ml/4min،10-20ml/hour  -5قبل از تهيه هموليزات بايد نمونه خون تام كامال" مخلوط شود -6پس ازتهيه هموليزات بهتراست سريعتركروماتوگرافي انجام شود ( پس از ليز كامل گلبول هاي قرمز ) -7قبل از نمونه گذاري به هيچ وجه نبايد رزين خشك شود .به محض اينكه محلول رِو یی رزين خارج شد بايد هموليزات به ستون اضافه شود. -8از سمپلر کالبیره باید جهت برداشت نمونه خون ،بافرو همولیزات استفاده نمود. -9باید از لوله های مدرج استاندارد جهت جمع اوری هموگلوبین A2از ستون و تهیه لوله توتال استفاده نمود.در صورت عدم دسترسی به لوله های فوق لوله های معمولی را به روش دستی (قلم الماس ،ماژیک) مدرج نمائید. -10افزودن هموليزات بايد به آرامي و درست در سطح رزين صورت گيرد و سطح آن نبايد در هنگام نمونه گذاري آسيب ببيند. -11بهتراست از يك نوك سمپلر جهت ریختن هموليزات بداخل ستون و لوله توتال استفاده شود .  -12به محض جذب شدن هموليزات برروی رزين بايدبالفاصله بافر اضافه شود -13اگر قبل از جذب كامل هموليزات برروی رزين ،محلول بافر ريخته شود باعث كاهش كاذب هموگلوبين A2مي گردد. -14بايد دقت شود تمامي بافر اضافه شده از ستون خارج شود. -15قبل از خواندن جذب نوري ،بايد لوله A2 و توتال كامال" مخلوط شوند.  -16بايد از يك اسپكتروفتومتر كاليبره جهت خواندن جذب نوري لوله ها استفاده شود. -17بهتر است از نمونه كنترل صحت تجاري در هر سری كاري استفاده شود در صورت عدم دسترسي ،يك نمونه که هموگلوبين A2آن مشخص شده است به عنوان نمونه كنترل گذاشته شود. • • • • این متد برای اندازه گیری هموگلوبین A2اختصاصی نیستبطوری که بسیاری از هموگلوبین های همبار با هموگلوبین ‏A2نیز از ستون خارج می شوندکه شامل هموگلوبین C,E,O arabو بعضی از واریانت های هموگلوبین )A2 (A'2و زنجیره دلتا میباشند .لذا هموگلوبین A2از این هموگلوبین ها قابل تفکیک نیست. در مواردی که هموگلوبین A2بیشتر از %7می باشد باید بهوجود هموگلوبین های C,E,O arabشک نمودکه همراه با هموگلوبین A2از ستون خارج می شوند.در این مورد نیاز به بررسی تکمیلی نظیر الکتروفورز هموگلوبین در PH=8.4و PH=6-6.2و بررسی فامیلی می باشد. اگر همه همولیزات اضافه شده یکباره از ستون پِایین آید ،باید بهوجود سایر هموگلوبینوپاتی ها شک نمود .بیمار هموگلوبین Sیا ‏Dو Gو یا هموگلوبین E,Cدارد. اندازه گیری هموگلوبین A2به روش کروماتوگرافی ستونی نبایددر بیمارانی که اخیرا خون دریافت کرده اند صورت گیرد. تفسیر دامنه مرجع% وجود هموگلوبین A2به تنهائی بسیار نادر است -موارد نادر موتاسیونهای βتاالسمی <7 صفت βتاالسمی -هموگلوبین ناپایدار -صفت هموگلوبین -Sآنمی داسی شکل -آنمی مگالوبالستیک 7-3.8 فقر اهن بسیار شدیدهمراه با صفت βتاالسمی همراهی واریانت های زنجیره دلتا( ) ςبا صفت βتاالسمی ثاثیر متقابل تاالسمی αو β موتاسیونهای نادر βتاالسمی حضور هموگلوبین ( Sدر این مورد صحت اندازه گیری هموگلوبین A2مشکل می شود ) ثاثیر متقابل تاالسمی αو هموگلوبین S -خطاهای آنالیتیکال(آزمایش باید تکرار شود) 3.7-3.4 فرد طبیعی دلتا بتا ( )ς βتاالسمی(اگر هموگلوبین Fباال باشد) موارد نادر صفت βتاالسمی(شامل همراه شدن βبا دلتا تاالسمی و αو βتاالسمی)صفت αتاالسمی 3.3-2 دلتا بتا ( )ς βتاالسمی(اگر هموگلوبین Fباال باشد) صفت αتاالسمی بیماری هموگلوبین H -حضور واریانت های زنجیره دلتا >2 • βThal. With Normal HbA2: 1-Heterozygotes with N. A2 βThal. (type1) HbA2 N,Indices N.or ↓(silent βThal. ) 2- βThal +Delta Thal. (Type2) Indices↓. HbA2 N, HbF↑ • Double Hetro. For α & βThal. MCV N., MCH ↓or border line,Hb A2 about 3.2 ► DNA Study .ALKALINE ELE • Principle: Electrophoresis is the movement of charged particles within an electrical fields.At PH 8.4 Hbs are negatively charged anions →Anod * Supporting Media : Cellulose(Acetate cellulose) Gel(agarose polyacrylamide,starch) * Sample: Hemolysate (Hb→20-30g/l) * Equipment: Chamber,Power Supply,Cellulose AcetateMedium,Applicator * Reagents: 1- Buffer: TEB →pH 8.4-9.2 2-Stain: non specific→Panceau S Specific →o-tuluidine,o-dianisidine 3-Destaining →5%acetic acid -Dehydration →Methanol -Clearing Errors • • • • • • • • • Cloudy or cont. Buffer Buffers of improper PH or ionic strength Cont.of sample wells, applicator ,blotter…… Cloudy or old hemolysate metHb→5%KCN Improper presoaking&blotting of cellulose strips Delay in applying Sample Improper placement of sample Leukocytosis →Anodal than Hb H (leu. Myeloperoxidase) GlycoHb →band Anodal to Hb A + - H,I,J A F Lepore,S,D,G A2,C,E,O CA )+(Anode C ..…… C-Harlem......... S O arab .……… ....................... Origin ............AD,E,G,Lepore,H,I,N, Barts .............F -(Cathode ( Anode Catode + H A A F PH= 8.6 S, DG CA A2,C, OarabE Origin Anode Catode C PH=6 S,Charlem origin O-arab A,D, E,G, H F,Barts • Cation Exchange Choromatography interchange of charge group on the ion exchange material(negatively stationary charge)with charge group on Hb (positively charge)molecule. • Adventages: -Automated -Very small sample are sufficent -Quantification of N.&Var. Hb are available • Disadvantage: -expensive -Co-elute some variants together HPLC Usually separates HbA,A2,F,S,C,D,&G from each other. Hb E&Lepore co-elute with Hb A2. GUIDELINES FOR INTERPRETAION A1a -A1b –F -LA1C/CHb -A1C –P3 - A0 -A2- S –C Total Area of Each Analysis:1.0-4.0 millvolt/sec Quality Control Values are in Ranges :Reportable RangeA1c:3.7%-18.4%- A2:1.5%-11.4% - 0.8%-16.5% )*(→out of range A1c out side of reportable range should not report A2&F →less than 1.5%or less than 1% greater than 11.4% or16.5% Limitation HbF>16.5%, HbF may elute in LA1c/CHb or .A1c window and no Hb F will report HbA1c >18.4% should be tested for possible of Hb Variant interference Hb A2>10 % should be tested for possible presence of Hb Var. Hb D &Hb E are coelute with Hb A2 Hb E samples may generate carry over in the subsequent injection A degradation peaks may coelute with the HbA2 peak when samples contains Hb S which have not been stored appropriately review HbA2 peak shape for all Hb S samplesbefore report A degradation peaks may interfere with the - measurement HbA1c when samples contains varients D &E have not been stored appropriately . do not report A1c result if an unKnown peak is identified between A1c& P3 Samples with Hb varients should be checked .for Hb A2&A1c peak shape :Typical E-Beta thal Sample high F peak shifted to La1c/Chb window HbA2>10% (HbE) HbF: 1.0%; HbA: 38.7%; HbA2: 4.4%; HbS: 56.1%is POSITIVE; Peripheral smear with 2+ sickle cells Sickledex Solubility test • Sickling Hb, in deoxygenated state (dithionite Na2S2O4) is insoluble & forms a precipitate at high molarity Phosphate buffer • Test not specific for Hb S,Report :Pos or Neg . Pos test did not distinguish Hb AS,SS, S/β+ …. • Sample: whole blood →packed cell • Control: Pos. Control About 30-45% Hb S, Source of error • • • • • • Inactive or out date reagent False negative result: Anemia,infant<6 months, resent transfusion Improper Tem.of Reagents Improper mixing of the specimen with Reagent Improper interpretation of the reader scale False Posative result:persons with paraproteinemia,hyperlipidemia, leukcocytosis Unstable Hb (after spleenectomy ,Heinz body • Sickle cell anemia: – In sickle cell trait, usually see HbS concentrations of 35 to 45% of total Hemoglobin because the HbS has a slower rate of synthesis than HbA • If HbS is less than 33%, start thinking about S-alphathalassemia • If HbS is greater than 50%, worry about S-Betathalassemia or Sickle cell disease with transfusion Expected ratios HbF HbA HbS HbA 2 1< 2-3 5-10 2-3 1< 2-3 5-10 .Inc 5-10 .Inc 4045 9095 25 9095 6090 5560 0 Hb AS Hb SS 75 0 Hb S-α-thal Hb S- β thal major 530 Hb S- β thal minor Hb F • alkalane denaturation (bethke) Hb F 2-40% • Column chromatograpy HbF >40% • Immunological methods H b <2% • Hb→ HICN →NaoH →Hb denaturation →Amonium sulfate (stop solution ,↓PH precipitates the denature Hb) filtered→ Hb F measured at 540 nm • Difference of duplicate: 0.5%→ HbF 0-5% 1% → HbF 5-15% 2% → HbF >15% • Final concenteration of NaoH & Amonium sulfate solution are critical