صفحه 1:
patch-clamp تكنيك
صفحه 2:
Scumz patch-clamp تكنيك
Bert Sakmann » Erwin Neher , تكنيكم300اء <ا:63 را ذراواخر 19705 و
اوليل19805 ارلئه دادند كه لينكشفم لمكانئ بسجريانا كتريكيكانالهائتكيوني Evin Neher
را برایاولینی ارفراهم کردکه مشارکنآنها در ف رلیندهايسلولب نياديمانند عم Bert Sakmann
هدليتيتانسيلي تايتشد. سس
تکنيك ۴۵۲6۲-۱۵۴0۵ يا ۳۵۵۱-۱۵00۵۳9 , يك نکنيك آزماشگاهي در Nobel 1991(
الكتروفيزيولوژي است که به طور گسترده امکان بررسي کانال هاي جنديوني وتك Lane
يوني واندازه گيري جریان هاي عبوري آنها را در سلول های زنده ي جدا شده , بخش
sla بافتي یا patch هايي از غشا سلولي فراهم مي كند. اين جريان فقط در زمان
كوتاهي که کانال باز است , وجود دارد.
, بخشکوچکیاز غشایسلولیو Clamp , يه معناونكه داشتزيككميت
فيزيكيمعيزقا مقدار تابناست
اين تكنيك را مي توان براي انواع متفاوتي از سلول ها به ويزه سلول هاي تحريك
پذیر مانند نورون ها , کاردیومیوسیت ها , فييرهاي عضلاني و سلول هاي بنابانکراس
به کاربرد .
علاوه براین موارد , بررسي تعاملات سيناپسي هم با اين تکنيك انجام مي شود.
/ ۰ ازاین نکنيك همچنین مي توان براي مطالعه ي کانال هاي يوني باكتري در
اسفروپلاست هاي غول پیکر نهیه شده ي مخصوص استفاده کرد.
صفحه 3:
صفحه 4:
wo L, patch-clamp shiss توان با استفاده از تكنيك ۷۵۱۲۵96-013۳00 نیز اجراکردکه
see بش , ولتاژ غشاي سلولي توسط آزمایشگر کنترل مي شود و جريان هاي
ان ثبت مي شود.
اساساتکنيك 0۵۱6-۳۵ خيلي شبیه به تكنيك ۷۵۱۲۵96-13۳0 است اما در
مقیاس کوچکتر به کاربرده مي شود.
براي اجراي تكنيك 03۷۳-013۳0۱0 , همچنین مي توان از تکنيك 0۱1۲۲6۳۸-۵۱۵۲۴0 نیز
استفاده کرد که در این حالت , جریان عبوري از غشاء توسط آزمایشگر کنترل مي
شود و تغیبرات پتانسیل حاصل ثبت مي شود.
بیشترین سیگنال هاي مورد مطالعه ,ولتاژ و پتانسیل الكتريكي سلول يا غشا هستند که
از طریق روش هاي مذکور حاصل مي شوند.
با استفاده از این تكنيك ها مي توان درباره ي ويژگي هاي يك نورون استنباط کرد تا
بفهمیم که چطور يك متخصص اعصاب , این سیگنال ها را به دست مي آورد.
صفحه 5:
ایند اه
Measured In; Voltage-Clamp.
صفحه 6:
چرا از (so orlaiwl patch-clamp Liss شود؟
ثبت جریان کم نویز را فراهم مي کند.
دسترسي به داخل سلول را فراهم مي کند.
مي تواند يك الکترود را به داخل سلول وارد کند.
مي توانند جریان داخل سلولي را تغییر دهند.
امکان اندازه گيري جریان الكتريكي و پتانسیل کل سلول را فراهم مي کند.
امکان انتشار بین سلول و پیپیت فراهم مي کند که ازاين طریق مي توان داروها را به
سلول تزریق کرد.
امکان مطالعه در مورد اثر عوامل شيميايي خارج سلولي را فراهم مي کند.
يك عایق بسیار قوي نفوذناپذیر (۱۳۱۵6۵۲۳۲6۵0۱6 اع) در برابر جریان هاي يوني به
وجود مي أورد.
امکان اندازه گيري جریان عبوري از کانال يوني را در مقابل ولتاژ , زمان و درجه ي
(SS ies skal Feb
صفحه 7:
جریان ها:
* جریان هايي که از کانال هاي تك يوني مي گذرند , جریان هاي میکروسكوپي
(Microscopic currents) نامیده مي شوند.
> از اين جهت این جریان ها میکروسكوپي نامیده مي شوند تا از جزیان هاي ماکروسكوبي
aS (macroscopic currents) از طریق تعداد زيادي کانال در يك منطقه ي گسترده تر
سطح غشاء توزیع شده اند, متمایز گردد
۴ جریان ثبت شده توسط 03۲۳-013۲00 باز يا بسته بودن کانال را مشخص مي کند.
current (pA) >
صفحه 8:
اصول اولیه ي تکنيك :patch-clamp
patch-clamping dist lugs olye براي ثبت
يك پیبت شيشه اي یا از جنس کوارتز نازك (میکرویبت) با 2316
پییت با فطر(سرباز) حدود 1 میکرومتر است که حاوي يك الكترود
نقره کلرید (۸9/۸96) در يك محلول الکترولیت مناسب (۲6۱)است
تایون ها را هدایت کند.
توجه:
باتوجه به آنچه که آزمایشگر در تلاش براي اندازه گيري آن است ,
قطر نوك پیپت استفاده شده ممکن است متفاوت باشد اما با اين
حال معمولاً در محدوده ي میکرومتر مي باشد icone scrote
این محدوده ي میکرومتر باید طوري باشد که بتواند يك سطح غشاء
patch L که آغلب حاوي يك یا تعدادي کانال يوني است , دربر بگیرد.
داراي يك الکترود دیگر که در ظرف (0280) محلول اطراف سلول مس
فرارگرفته و به عنوان الکنرود مرجع زمين عمل مي كند. =
ممکن است يك مدارالكتريكي بین الکترود ۸9/۵96۱ و مرج با
سلول موردنظر بین آنها تشکیل شود conte
صفحه 9:
: Patch clamp jl.
۴ يك ۵۳00۱166۲ (تقویت کننده) عملياتي با بهره بالا به مدار متصل شده است
به طوري که جریان عبوري از کانال يوني را به صورت يك افت ولتاژ در ۴88
Crogli)feedback resistor L پسخوردي موازي با يك تقویت کننده ي
عملياتي براي كنترل ولتاژ)اندازه گيري مي شود.
" آمپلی فايري که براي ثبت جرپان هاي کانال مورد استفاده قرار می گیرد باید
از کیفیت بالا برخوردار بوده و ضمن دریافت و تجزیه و تحلیل جريانهاي کوچک
در حد 3-1 0۸ نویز بسیار پایینی تولید کند
” ۴88 دارایمقاومت50 160سنکه امکاناندززه گیریجریانهایخیلرک وچك
(10*<-12 أمپر( را فراهم ميکند.
‘Technical,
Sowra very smal curants 10°" A)
aL wbomeascees
صفحه 10:
در بعضي از آزمایش ها نوك ميكرويييت ذر يك میکروفورج گرم مي شود تا سطح صافي تولید شود و به قرار دادن پیپت به
طور محکم با مقاومت بالا روي غشاء سلول , كمك کند.
براي اينكه بيبت با مقاومت بالا در محدوده ي گیگااهم (60) روي غشاء سلول به طور محکم تر مهر وموم شود (يك عایق
بسیار قوي بین پیپت و غشا به وجود آورد که هیچ يوني نمي تونه بين پییت و غشا در جریان باشه مگر اینکه کانال يوني باز
شود) , باید روي غشاء سلولي فشرده و مکش ملایم اعمال شود.
يك بخشی از غشاء به داحل پیپت , مکش مي شود (جدا مي شود) و ناحیه ي غشايي به صورت امگا شکل حاصل مي
شودکه اگر این ناحیه به درستي تشکیل شود, يك مقاومت در محدوده ي 100-10 660 که گیگاسیل نامیده مي شود ,حاصل
مي شود.
با جداشدن 0806۱ غشا به صورت الكترونيكي , تمام یون هاي patch غشا به داخل پیپت مي ریزند و توسط يك الکترود
۸9/۸961 درون پیبت که Amplifier cb, a (تقویت کننده) به شدت حساس متصل شده است, ثبت مي شوند(جریان
الكتريكي به 30011666 هدايت مي شود)
طبق آزمايش , تركيب يوني ظرف حاوي محلول اطراف سلول (ممكن است با محلول فيزيولوزيكي خارج از سلولي تطابق
داشته ياشد) با محتواي محلول درون بيبت مطايقت دارد.
آزمايشكر مي تواند اجزا يا غلظت اين محلول (بيبت) را يا اضافه كردن يون ها و دارو براي مطالعه ي كانال هاي يوني در
شرايط مختلف تغيير دهد.
بسياري از 3000011667 هاي مختلف ۵01۱613000 , از الكترود مرجع زمين براي تنظيم سطح جريان صفر (زمين) استفاده
مي كنند واين به محقق اين اجازه را مي دهد كه در حين مشاهده ي تغييرات در جریان , پتانسیل را ثابت نگه دارد.
با استفاده از تكنيك ۷۵۱6296-1202 براي ثابت نگه داشتن پتانسیل, يك جرياني كه از نظر علامت , مخالف و ازنظر مقدا
با جریان عبوري از غشاء سلولي برابر است , توسط 300011866 به صورت يك مکانیسم بازخورد منفي تولید مي شود.)
روش گیره ولتاژ به یک آزمایشگر اجازه میدهد تا پنانسیل سلول را در یک مقدار انتخاب شده و در یک سطح مشخص نگه
دارد. اين امر میتواند اندازه گیری کند که چه مقدار جریان یونی در هر ولتاژ معین, از عغشای سلول عبور میکند.(
ثبت این جریان , امکان نتیجه ي گيري در مورد رسانايي غشاء را فراهم مي کند.
صفحه 11:
رب
SD suction
صفحه 12:
تصويري از uate cuy Patch Jb شده به غشاء يك نورون هییوکامپ کشت شده ي موش
صفحه 13:
تکنيك طعاوم 00-۵1۱ 0۳ 960هتا۵/۱-۵) (0عام هاي متصل به سلول یا روي سلول):
در اين تكينك الكترود (بيبت) به 0311 غشاء به طور محکم متصل مي شود (مهر وموم مي شود) و در واقع
يك ناحيه ي بسته را در اطراف يك تكه از(سطح خارجي) غشاء (03۱>1۱) ایجاد مي کند و سلول دستنخورده
باقي مي ماند.
اين روش امكان ثبت جريان ها را از ميان كانال هاي تك يوني يا جند يوني موجود در 0۵16 غشاء که
توسط بيبت كرفته شده است , بدون ايجاد اختلال در فضاي داخلي غشاء سلول, فراهم مي كند.
در مورد کانال هاي يوني وابسته به لیگاند (در پاسخ به اتصال لیگاند , باز مي شوند) یا کانال Silt توسط
كيرنده هاي 0061200100 تنظیم مي شوند , نوروترانسمیترها یا داروي مورد مطالعه معمولاً در محلول
پیپت گنجانده مي شوند که به این صورت ناسطح خارجي غشاء مي توانند تماس برقرار کنند.
در اين روش , اثر غلظت هاي مختلف يوني و حل شونده هايي مانند هورمون هاي خارج لو بر روي
کانال ها بررسي مي شود.
صفحه 14:
CELL-ATTACHED
CONFIGURATION
Mild
\ _-~ Recording
\" pipette
_|N =a ‘suction
( Cell
Tight contact is created
between the pipette and
the plasma membrane.
پیپت روي غشاء پلاسما قرارگرفته و براي اینکه به آن به طور محکم متصل شود , مکش ملایم
آنجام مي شود.
صفحه 15:
(ol Jglw patch ) Whole-cell recording or whole-cell patch تكنيك
=A) =
شامل ثبت جريان هاي يوني به صورت همزمان از میان چندین کانال روي کل غشاء
سلول آیست
.در 0300 هاي سلول کامل مانند 02۷ هاي متصل به سلول, الکترود در جاي خود
روي سلول باقي مي ماندامادر اين تكنيك 5008101 بيشتري براي ایجاد يك سوراخ
داخل غشاء (پارگي غشاء)استفاده مي شودبه گونه اي که میکروپیپت مي تواند به
محیط داخل سلولي دسترسي داشته باشد
.دراین روش از طریق انتقال واکنشگرها به سیتویلاسم از طریق میکروپپیت , مي
توان اثرآن را برروي تمام کانال هاي واقع در غشاي سلول بررسي کرد.در واقع
فعالیت کل سلول اندازه گيري مي شود.
صفحه 16:
> فواید:
٠ إدهانة يررك موك ميرو القبرود به كازيرده ستده :در آين :يوم كنيك , :باعت ايجاد
مقاومت يايين تر و دسترسي الكتريكي بيشتري به فضاي داخل سلول مي گردد.
& معايب :
حجم الكترور بزركتر از از مساو است بنابراين محتويات محلول داخل سلول به آرامي
با محتوبات الکترود جایگزین مي شود و هر خصوصيتي از سلول که به محتویات
we Se ey Bee oe ee مرو سول
سلول را دیالیز مي کند , معروف است)
صفحه 17:
CELLATTACHED WHOLE-CELL
CONFIGURATION CONFIGURATION
۱ ۵
۱ ۱ _ Recording
لم 1
صفحه 18:
sla w) inside-out patch Juss > داخل به خارج):
۳ wo
دراین 0286 هاي داخل به خارج پس از تشکیل گیگاسیل, میکروپیپت به سرعت ازسلول خارج مي
شود بنابراين 0360 غشاء در حالي كه به میکرویبپت متصل است نیز ازسلول خارج مي شود
«سطح درون سلولي غشاء در معرض محیط خارجي یا طرف وان حاوي محلول اطرف سلول قرار
مي كيرد .
اين روش زماني مفید است که آزمایشگر بخواهد محیط در سطح درون سلولي غشاء را دستكاري
کند.
این روش مي توان اثر واکنشگرهاي داخل سلولي رایرعملکردکانال به واسطه ي مجاورت
سرمیکروپبیت بامحلول هاي حاوي واكنشگرهاي مختلف راسنجید.به عنوان مثال :
کانال هايي که از طریق ليگاندهاي داخل سلولي فعال مي شوند,میتوانند از طریق يك طيفي از
غلظت هاي لیگاند موردمطالعه قرار بگیرند.
صفحه 19:
CELL-ATTACHED INSIDE-OUT
CONFIGURATION CONFIGURATION
| ci
re
1
Tight contact is created
between the pipette and
the plasma membrane.
۵۲6 غشا که مکششده , از سلولجدا ميشود به طوريکه امکاندسترسیبه دومینس: انال
یونیرا ف راهم ميکند.
صفحه 20:
w) outside-out patch suis» خارج به خارج):
inside-out ayi 9 cuwl oss aisly whole-cell patch اين تكنيك از كنفيكوراسيون
است.
در اين حالت , پیپت روي کل سلول هل داده شده و الکترود مي تواند به آرامي از سلول
خارج شود که باعث خارج شدن حبابي( ناحیه ي كوچكي )از غشاء مي شود .
زماني که الکترود به اندازه ي كافي دورتر کشیده شود این حباب از سلول جدا مي شود
وبه صوزت يك غشاء برآمده در انتهاي الکترود (مانند يك توپ باز شده در نوك الکترود)
بازسازي مي شود
صفحه 21:
5 يعم ele) AL ام اويا كاف lS ثبت جریان از کانال
بي ممکن است.یج خارج به خارج , فرصتي را براي ازمایشگر فراهم مي
كد pase estos ly oe a ee ele ۳ 7
در دسترس محلول هاي مختلف روي سطح آگزوپلاسمي غشا قرار گرفته است را
بررسي
دراين روش مي توان اثر ترکیبات خارج از سلولي بر روي کانال را بررسي کرد.
مزیت :
ازمایشگر مي تواند از يك ۵۵۲6/۱ براي تزریق محلول هاي مختلف استفاده کند.
عیب:
ازانجايي که مراحل بيشتري در اين نوع روش 13۳08 0216 , وجود دارد , انجام ان
مشکل
تر است.
صفحه 22:
WHOLE-CELL
CONFIGURATION
(The pipette has direct
accesso the cytoplasm.
CELLATTAGI
(CONFIGURATION
Recording ا
et
ات ۴
ca ۱
(Tight contactisceated |
etree the pipette and
the plasma membrane
OUTSIDE OUT
ConeIGURATION
| از Rte
م
> ae
سار
The exracelalar do
of te ion channel
ow accessible
“The pipette i retraced
from the cel
صفحه 23:
patch > ۵۲۲۵۲۵۱6۵ (یچ حفره دار):
Sl
نوعیاز تکنيكیج سلولکاملاست آزمایشگر لتصا (محکم , ۲۵۲۲۵۲۵۱۵۵ 2
بینپ پپنو غشاء را تشکیلميدهد اما 50۷0۳ برایی ارگیبج غشاء به کاربرده
نميشود.
محلول الور در اين نوع 0206 حاوي مقادیر کمي از يك عامل آنتي بيوتيك یا ضد
. قارج مانند أمفوتريسين-8 , نيستانين يا كراميسيدين مي باشد
زماني که مولکول هاي انتي بيوتيك به داخل 03۱1۱ غشايي انتشار پیدا مي کند , حفره
هاي كوچكي در غشاء تشکیل مي شود که امکان دسترسي الكتريكي به داخل سلولي
را فراهم مي كلد
صفحه 24:
متا
دیالیز سلولي که در 0316/۱ سلول کامل اتفاق مي افتد, در اين نوع 0306 اتفاق مي
افتد.
معایب:
نسبت به پچ سلول کامل, به دلیل ایتکه مقدار کوچكي از غشاء توك الکترود: را اشغال
کرده است: مجموع مقاوفت الکتزود و مقاومت موجود در محل اتصال سلول و
الکترود بالاتراست. این حالت موجب کاهش دسترسي الكتريكي به داخل سلول و در
نتیجه کاهش وضوح جریان , اقزایش 0156 و بزرگ تر شدن هر گونه خطاي مقاومتي
مي شود.
ممکن است زمان زيادي طول بكشدتاانتي بيوتيك , حفره اي در غشاء ایجاد کند (10-
0 دقیقه , اگرچه مي توان به انستفاده از الكترودهايي با شکل مناسب , این مقدار را
کاهش داد)
غشائي که نوك الکترود را اشفال کرده است , به دلیل حفره هاي ایجاد شده توسط
انتي بيوتيك ضعیف و مي تواند پاره شود . اگر پچ پاره شود , در حالت پچ سلول کامل
در حالي که داخل سلول توسط انتي بيوتيك آلوده شده است , قرار مي گیرد.
صفحه 25:
UY و
۱
waa
lon channel S&S: Cytoplasm
ین
صفحه 26:
: (يج شل) loose-patch Juss >
اين تتوع پچ کلمپ نسبت به انواع دیگر, از این جهت متقاوت است که به جاي اتصال محکم
كيكاسيل بين پیپت و غشاء , اتصال سستي برقرار مي کند (مهر و موم ضعیف)
فواید:
" پیپت مورد استفاده در اين نوع تكنيك را مي نوان به طور مکرر بعد از ثبت جریان از غشاء جا کرد
و غشاء دست نخورده باقي مي ماند.
امکان اندازه گيري مکرر جریان را در مکان هاي مختلف يك سلول بدون از بین بردن يكبارچگي
غشاء فراهم مي کند.
معایب:
مقاومت بین غشاء و پیبت به شدت کاهش مي یابد كه موجب نشتي جریان مي شود.
صفحه 27:
کاربردها و محدودیت ها:
| ۶ کاربردها:
ارزيابي عوامل ضد آريتمي
در سلول هاي كليه
مورد استفاده در ميوسيت هاي بطني جدا شده ي خوكجه هندي براي مطالعه ي مهار كزينشي SUIS
يتاسيم حساس به ۸۵۲۳ قلب
شناسايي انواع مختلف گانال هاي کلسیم
استفاده شده در بيولوژي مولكولي
مطالعات ولتاژکلمب بر روي کانال هاي سدیم
مورد استفاده در بررسي طیف گسترده اي خواص الکتروفيزيولوژي سلول
اندازه گيري رسانايي غشاء سلول
سيگنالدهي سلول
محدودیت ها :
هزینه ي فرایند, گران است.
زمان بر
در مواقعي تعداد نمونه هاي مورد نیاز بیشتر است.
احتمال تخریب غشاء وجود دارد