علم ژنتیک

علم ژنتیک

اسلاید 1: In the name of ALLAH

اسلاید 2:

اسلاید 3: Under supervision of Dr.FATHI exercise physiology university of mazandaran

اسلاید 4: What genes?ژن ها حامل اطلاعاتي هستند که تعيين کننده ي ويژگي هاي شما هستند.هر سلول بدن انسان شامل 25000تا 35000 ژن است.ژن ها روي کروموزم قرار دارند.کروموزم ها به صورت جفتي هستند و روي يک کروموزم صدها و يا شايد هزاران ژن وجود دارد.ژن ها و کروموزم ها ازِ DNA تشکيل شده اند

اسلاید 5: ژنها قطعاتی از یک کروموزوم هستند که اطلاعات مورد نیاز برای یک مولکول DNA یا یک پلی پپتید را دارند. علاوه بر ژنها، انواع مختلفی از توالیهای مختلف تنظیمی در روی کروموزومها وجود دارد که در همانند سازی، رونویسی و ... شرکت دارند.متابولیزم DNA :سلامت DNA بیشترین اهمیت را برای سلول دارد که آن را می‌توان از پیچیدگی و کثرت سیستم های آنزیمی شرکت کننده در همانند سازی ، ترمیم و نو ترکیبی DNA ، دریافت. همانند سازی DNA با صحت بسیار بالا و در یک دوره زمانی مشخص در طی چرخه سلولی به انجام می رسد. ژن ها و کروموزوم ها:

اسلاید 6: متابولیزم RNA :رونویسی توسط آنزیم RNA پلیمراز وابسته به DNA کاتالیز می‌شود. رونویسی در چندین فاز ، شامل اتصال RNA پلیمراز به یک جایگاه DNA به نام پروموتور ، شروع سنتز رونویسی ، طویل سازی و خاتمه ، روی می‌دهد. سه نوع RNA ساخته می‌شود. متابولیزم پروتئین :پروتئینها در یک کمپلکس RNA پروتئینی به نام ریبوزوم ، با یک توالی اسید آمینه‌های خاص در طی ترجمه اطلاعات کد شده در RNA پیک ، سنتز می‌گردند.

اسلاید 7: تاریخچه ژنتیکگریگور مندل در سال 1865 قوانین حاکم بر انتقال صفات را کشف کرد.در سال 1900 میلادی کشف مجدد قوانین ارائه شده از سوی مندل، توسط «درویس»، «شرماک» و «کورنز» باعث شد که نظریات او مورد توجه و قبول قرار گرفته و مندل به عنوان پدر علم ژنتیک شناخته شود.در سال 1953با کشف ساختمان جایگاه ژنها ازسوی جیمز واتسن و فرانسیس کریک، رشته‌ای جدید در علم زیست شناسی به وجود آمد که زیست شناسی ملکولی نام گرفت.

اسلاید 8: تقسیم بندی علم ژنتیک ژنتیک مندلی ژنتیک جمعیت ژنتیک مولکولی ژنتیک مندلی یا کروموزومی بخشی از ژنتیک امروزی است که از توارث ژنهای موجود در روی کروموزوم‌ها بحث می‌کند، اما برعکس در ژنتیک غیر مندلی که به ژنتیک غیر کروموزومی نیز معروف است، توارث مواد ژنتیکی موجود در کلروپلاست و میتوکندری ، مورد تجزیه و تحلیل قرار می‌گیرد.

اسلاید 9: REAL TIME PCR

اسلاید 10: مقدمه به طور طبیعی از تکنیک RT-PCR برای مشخص نمودن الگوی بیان ژنهای مورد نظر در شرایط متفاوت و همچنین برای تعیین ساختار RNA استفاده می شود. باید توجه داشت که RT-PCR یک تکنیک پیچیده ای است که کلیه عوامل فیزیکی و شیمیایی دخیل در آن به هم وابسته هستند لذا تکرارپذیری ، حساسیت و ویژگی تست به بهینه سازی تکنیک و برقراری تعادل بین این عوامل بستگی دارد.

اسلاید 11: gene expression در سلول

اسلاید 12: همانند سازی ژن درPCR

اسلاید 13: بيان ‍ژن بیان ژن فرایندی است که در آن اطلاعات درون ژن استفاده می شود تا یک محصول کاربردی از آن به دست آید. منظور از بیان ژن یعنی استفاده ازآن ژن به منظور تولید RNA و یا پروتئین است . وقتی ژنی مورد استفاده قرار می گیرد می گویند آن ژن بیان شده و روشن است و وقتی كه یك ژن مورد استفاده قرار نگیرد می گویند ان ژن خاموش است. اینكه در زمان مشخصی كدام ژن روشن و كدام ژن خاموش باشدبه تنظیم بیان ژن معروف است.

اسلاید 14: مثال ساده از تنظيم بيان ژنباكتری E.coli در دستگاه گوارش مازندگی می كند و منبع انرژی آن قند گلوكز است. در صورت فقدان گلوكز می تواند ازلاكتوز (گلوكز+گالاكتوز)نیز برای تأمین انرژی استفاده كند. پس درفقدان گلوكز این باكتری نیاز به آنزیم های جذب و تجزیه لاكتوز دارد. بنابراین در صورت وجود گلوكز نیازی به این آنزیم ها نمی باشد و ژن مربوط به آن خاموش است ولی وقتی كه گلوكز در محیط نیست و لاكتوز وجود دارد ژن مربوط به جذب و تجزیه لاكتوز بیان شده و روشن است.

اسلاید 15: تفاوت تکثیر ژن در سلول و آزمایشگاهتکثیر ژن در DNA یک بار انجام می شودتکثیر در آزمایشگاه می تواند چندین بار تکرار شود.مثلا تکثیر در PCR می تواند 30 تا 35 بار تكرار شود.همانندسازی در سلول کل ژن ها را تکثیر می کنددر آزمایشگاه می توانیم یک قطعه خاص از DND را تکثیر کنیم(این بخش می تواند یک ژن خاص،اینترون و اگزون باشد).

اسلاید 16: روش هاي اندازه گيري بيان ژنكمي نيمه كمي semi-quantitative Quantitative دستگاه ريل تايم دستگاه پي سي آر(الكتروفورز)

اسلاید 17: روش اندازه گيري نيمه كمي:Polymerase Chain Reaction PCR (واکنشهای زنجیره ای پلیمراز)

اسلاید 18: Introduction to PCR PCR was invented in 1984 by ( Kary mullis ) & he received the Nobel Prize in chemistry in 1993, for his invention.

اسلاید 19: از سال ۱۹۸۰ به بعد عمدتا از روش PCR (واکنشهای زنجیره ای پلیمراز) در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود. در این روش با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان فرآیند تکثیر DNA را بدفعات انجام داد. امروزه این تکنیک به عنوان یک روش قدرتمند در تشخیص بالینی برای بررسی وجود موتاسیون‌ در ژنوم انسانی، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژنها و همچنين تعيين غلظت مواد استفاده می شود

اسلاید 20: کاربردهای PCRتشخیص بیماریهاتحقیقات جناییانگشت نگاری ژنتیکبررسی DNA قدیمیجداسازی DNAی ژنومیتعیین توالی

اسلاید 21: انواع PCRRT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) Nested-PCRMultiplex-PCRARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-PCR) HDP:helicase dependent pcr

اسلاید 22: RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) الگوی اولیه در RT-PCR، مولکول RNA تک زنجیره ای است. از آنجائیکه DNA پلیمراز قادر به استفاده از RNA بعنوان الگو نمی باشد، مرحله دیگری به PCR اضافه شده است. طی این مرحله، با استفاده از آنزیم رورس ترانس کریپتاز ((Reverse Transcriptase RT ، از الگوی RNA، مکمل آن DNA‌C (complementary DNA) سنتز می شود و بوسیله تکنیک PCR تکثیر می یابد. بمنظور تعیین گونه و حساسیت دارویی در ویروس شناسی و مایکوباکتریولوژی، از این روش برای تکثیر RNA ریبوزومی استفاده می شود.

اسلاید 23:

اسلاید 24: Nested-PCR در این روش بمنظور افزایش حساسیت PCR از دو جفت پرایمر استفاده می شود. ابتدا با یک جفت پرایمر اول در طول 30-15 چرخه، قطعات مشخصی از DNA هدف تکثیر می یابند. سپس محصول PCR حاصل به لوله دیگری منتقل شده و بعنوان الگو استفاده می شود و بوسیله جفت پرایمرهای دوم مرحله دوم PCR انجام می شود.

اسلاید 25:

اسلاید 26: Multiplex-PCR در این روش از چند جفت پرایمر اختصاصی برای هدف های مختلف استفاده می شود. در میکروب شناسی بالینی، با استفاده از این روش امکان شناسایی چندین عامل بیماری در یک نمونه بطور همزمان وجود دارد و می توان عفونت های مخلوط را تشخیص داد.

اسلاید 27:

اسلاید 28: ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-PCR) روش آرمز _ پی سی آر (ARMS-PCR) برای تشخیص موتاسیون های نقطه ای بکار می رود و از دو جفت پرایمر استفاده می شود. در این روش، واکنش در دو لوله جداگانه انجام می شود که یکی از آنها حاوی پرایمرهای نوع موتاسیون یافته و دیگری حاوی پرایمرهای نوع معمولی است. چنانچه تکثیر در لوله حاوی پرایمر موتاسیون یافته انجام شود، در DNA هدف، موتاسیون اتفاق افتاده است و تکثیر در لوله حاوی پرایمر معمولی، نشان دهنده آن است که موتاسیونی اتفاق نیفتاده است. از این متد می توان در تشخیص موتاسیون های مولد مقاومت دارویی در باکتری‌ها استفاده کرد.

اسلاید 29:

اسلاید 30: HDP:helicase dependent pcrدر این نوع pcr به جای افزایش دما از هلیکاز برای جداسازی دو رشته DNA استفاده می شود

اسلاید 31: تخليص RNA: مقدار 50 تا 100 ميلي گرم از بافت مورد نظر (كبد موش ...)را با روش هموژنيزه كردن(با نيتروژن مايع) پودر كرده و با كيت مخصوص RNA تخليص مي گردد. سپس تا زمان استفاده از آن در PCR آن را در يخچال با دماي 70- درجه سانتي گراد قرار مي دهيم.

اسلاید 32: ***در استخراج RNA باید از دستکش استفاده کرد.زیرا سلول های مرده پوست RNAse تولید می کنند که باعث تخریب RNA می شود.از بین بردن RNAse حتی از طریق اتوکلاو کردن هم صورت نمی گیرد.پس آب و تمام وسایل باید از RNAse استریل شوند.برای استریل میکروتیوب ها از ماده ای به نام Depc (دی اتیل پیرو کربوکسیل)استفاده می شود.تذکر:بخارات Depc و تماس آن با پوست به شدت خطرناک و سرطان زاست.

اسلاید 33: cDNA به RNA تبديل RNA نمی تواند به عنوان الگو در PCR استفاده شود پس اولین مرحله رونویسی معکوس از روی RNA و تولید cDNA می باشد. سپس این الگو با PCR به صورت نمایی تکثیر یافته و میزان آن افزایش می یابدContaminations like RNAs must be removed by RNase.

اسلاید 34: cDNA به mRNA .دلایل تبديل1-RNA خيلي حساس است.(چونRNA ناپایدار است باید به CDNA تبدیل شود)*از میان انواع RNA فقط mRNA به cDNA تبدیل می شود2- RNAاگر دي فريز شود از بين مي رود.3-cDNA خيلي مقاوم تر از mRNAاست حتي اگر 2 روز هم در محيط بيرون يخچال بماند خراب نمي شود.4-آنزيم Taq نمي تواند mRNA را به صورت الگو قرار دهد لذا نخست توسط آنزيم هاي نسخه بردار معكوس ناشي از ويروس هايي مثل(Moloney Murien Leukemia Virus) Mo-MLV و AMV(Avian Myleo-blastosis Virus)، مولكول mRNA به cDNA تبديل مي شود و سپس Pcr معمولي انجام مي شود

اسلاید 35: اجزاي مورد نياز در Pcr:

اسلاید 36: template DNA: DNAی الگو: شامل DNAی هدف است که تکثیر می گردد.پرایمرهای Forward و Reverse: به گونه ای طراحی شده اند که هر یک مکمل ناحیه َ۳ در یکی از رشته های DNA باشد.Taq polymerase(Thermus aquaticus) یا DNAپلیمراز دیگری که دمای بهینه اش در حدود ۷۰ درجه سانتیگراد باشد.

اسلاید 37: free nucleotides (dNTPs for DNA, NTPs for RNA) مصالح ساختمانی که توسط DNA پلیمراز برای ساختن رشته های DNAی جدید بکار میروند.Buffer: محلول بافر:(کاتیونهای دو ظرفیتی: یونهای منیزیم یا منگنز) شرایط محیطی مناسبی را از نظر pH و یونهای مختلف ایجاد میکند تا پایداری DNA پلیمراز و فعالیت بهینه آن تامین شود.*ویال(میکروتیوپ):لوله های کوچک آزمایشگاهی که نمونه ها در آن قرار می گیرند*سمپلر:وسیله ای برای انتقال محلول به درون ویال

اسلاید 38: PCRمراحل دستگاه Initialization step*: مرحله شروع به مدت ۱ تا ۹ دقیقه دمای محلول به ۹۴ تا ۹۶ درجه (یا ۹۸ درجه اگر پلیمرازها کاملا به حرارت مقاوم باشند) رسانیده میشود. این مرحله فقط برای DNA پلیمرازهایی ضروری است که نیازمند فعال شدن توسط حرارت در روشhot-start PCR هستند.1) Denaturation step : مرحله واسرشتدما:94 درجه سانتي گراد زمان:30 ثانيه تا يك دقيقه در این مرحله بعلت گسستن پیوندهای هیدروژنی (بین نوکلئوتیدها)، DNAی الگو و پرایمرها از هم جدا میشوند و تک رشته های DNA حاصل میگردد.

اسلاید 39: 2) :Annealing stepمرحله اتصالدما: ۶۵ – ۳۰ درجه سانتي گراد زمان:30 ثانيه تا يك دقيقه در این مرحله پرایمرها به تک رشته های DNAی الگو متصل می شوند. بطور طبیعی، دمای اتصال در حدود ۳ الی ۵ درجه پائین تر از نقطه ذوب پرایمرها است. پیوندهای هیدروژنی پایدار فقط زمانی شکل میگیرد که سکانس پرایمر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند. آنزیم پلیمراز پس از اتصال به هیبرید پرایمر-الگو، همانند سازی DNA را آغاز میکند.3) :Extension مرحله طويل شدندما: 72درجه سانتي گراد زمان:30 ثانيه تا يك دقيقه در این مرحله آنزیمDNA پلیمراز با استفاده از dNTP های موجود در محلول، یک رشته DNAی جدید را در جهت َ۵ به َ۳ و در مقابل رشته های الگو می سازد. در دمای بهینه، DNA پلیمراز در هر دقیقه، یک هزار باز را پلیمریزه می نماید.

اسلاید 40: در مرحله طویل شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تامین شرایط بهینه، مقدار DNA در محلول PCR دو برابر میشود. بنابر این در هر سیکل PCR، غلظت DNA بصورت تصاعدی افزایش می یابد.Final elongation *: مرحله طویل شدن نهایی این مرحله، پس از آخرین سیکل PCR، به مدت ۵ الی ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰ الی ۷۴ درجه انجام میشود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند.*Final hold : نگهداری نهایی در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است.*الکتروفورز در ژل آگارز: نهایتا میتوان محصولات PCR را بر روی ژل آگارز و همراه با مارکر وزن مولکولی(DNA lader که حاوی قطعات DNA با اندازه های مشخص است) الکتروفورز نمود، تا صحت انجام PCR بررسی شود.

اسلاید 41:

اسلاید 42: Animation and videopcr

اسلاید 43:

اسلاید 44: بعد از آنکه کار ما با دستگاه pcr انجام شد محصول یا قطعه قابل تکثیر را در ژل آگارز قرار داده وآن را در دستگاه الکتروفورز می گذاریم تا مقدار تکثیر ژن را نسبت به محصول استاندارد یا کنترل٭ (اکثرا بتا اکتین) نشان دهد٭ کنترل داخلی : به منظور کاهش تفاوتهایی که طی آزمایش بین نمونه های متفاوت به وجود می آید و در حقیقت برای یکسان نمودن نتایج آزمونها و حذف خطاهای آزمایش استفاده از یک کنترل داخلی ناگزیر است. این کنترل یک RNAی درون سلولی است که باید در تمامی سلولهای بافت مورد نظر به طور یکسان ساخته شود. و از طرفی نباید تحت تیمارهای آزمایش تاثیری بر تولید آن ایجاد شود.از آن جمله : ژن گلیسر آلدهید دهیدرژناز ، بتااکتین، بتا ـ دو میکروگلوبولین ، هیستون H3 ، سایکلوفیلین و آلدولاز را می توان نام برد .

اسلاید 45: الكتروفورز DNA روي ژل آگارز الکتروفورزد (به انگلیسی: Electrophoresis) به حرکات ذرات در یک مایع تحت میدان الکتریکی گویند.لغت فورز به معناي حركت و تحرك است و الكتروفورز در واقع حركت ذرات تحت تأثير ميدان الكتريكي را گويند.

اسلاید 46: به سبب اینکه ماکرومولکول‌های زیستی مانند دی‌ان‌ای و پروتئین‌ها باردار هستند می‌توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی بنام الکتروفورز استفاده می‌شود.

اسلاید 47: نماي ساده از دستگاه الكتروفورز:دستگاه الكتروفورز شامل يك محيط خلاء، يك الكترود منفي و يك الكترود مثبت در دو طرف ذره باردار مي باشد. اسيدهاي نوكلئيك داراي بار الكتريكي هستند. گروه هاي فسفات روي اسيدهاي نوكلئيك داراي بار منفي هستند. بنابراين رشته DNA داراي بار الكتريكي منفي مي باشد.(DNA دارای شارژ منفی است و برای الکتروفورز شدن باید  نمونه بطرف قطب منفی با شد  تا هنگام الکترو فورز به سمت قطب مثبت حرکت کند)

اسلاید 48: وقتي كليد باز است يا به عبارتي جريان الكتريكي قطع مي باشد ذره موردنظر در ميدان الكتريكي ثابت است و زماني كه كليد بسته است يا به عبارتي جريان الكتريكي وصل باشد ذره موردنظر به تنهايي و با سرعت شتابدار تا رسيدن به الكترود مثبت حركت كرده و برقراري جريان الكتريكي در تانك الكتروفورز همواره از الكترود منفي به سمت الكترود مثبت است. البته اين مطلب در مورد رشته DNA كه داراي بارالكتريكي منفي است صادق است.

اسلاید 49: تحرك الكتريكي معيار اصلي سنجش در جداسازي مولكول هاست. وجود ضريب اصطكاك f يك عامل مقاوم براي تحرك است. درحالي كه وجود بار باعث زودتر رسيدن ذره به قطب است. هرچه ذره بزرگتر باشد و شكل آن از حالت كروي دور باشد ضريب اصطكاك f بيشتري داشته و تحرك الكتريكي كمتري داراست.درواقع تحرك الكتريكي هر ذره وابسته به شكل و اندازه ذره و بار ذره است و ضريب اصطكاك نيز كميتي است كه ارتباط مستقيم با اندازه و شكل ذرات دارد هرچه ذره به شكل كروي نزديكتر باشد ضريب اصطكاك كمتري دارند.

اسلاید 50: سیستم های آنالیز نهایی محصول برای تعیین میزان محصول PCR و تفکیک دو قطعه از هم تکنیکهای متفاوتی استفاده می شود. یکسری از روشها بر اساس نشاندارکردن قطعات با پرب های رادیواکتیو کار می کند و روشهای دیگر براساس ELISA است که حساسیت بالایی را دارند. نرم افزارهای باند دنسیتومتری امکان آنرا ایجاد کرده اند که با اندازه گیری چگالی تراکم باند DNA بر روی ژل آگارز رنگ آمیزی شده با اتیدیوم برماید محصول PCR را به صورت کمی گزارش کنند. گر چه این روش از حساسیت دو روش فوق برخوردار نیست ولی در بسیاری از موارد کاربرد فراگیری دارد . 

اسلاید 51: Gel combsCasting trayGel tankPower supplyCoverElectrical leads Electrophoresis Equipment

اسلاید 52: وسايل موردنياز در الكتروفورز:1. دستكش2.كست (cast) و كمب (comb) Gel casting tray & combs

اسلاید 53: 3. ترازو (Balance) 4. سمپلر

اسلاید 54: 5. ماكروويو6. تانك الكتروفورز

اسلاید 55: 7. Power supply (جهت برقراري جريان الكتريكي در تانك الكتروفورز)8. دستگاه عكسبرداري Gel Doc

اسلاید 56: مورد نياز مواد1. پودر آگارز2. EtBr : اتيديوم برمايد (ماده اي بسيار سمي و موتاژن قوي است)3. TBE 1x 4. Loading Buffer 5. Marker 6. آب مقطر

اسلاید 57: 1) ژل آگارز: يك ژل پايدار است و قطر روزنه هاي آن بسيار بزرگ است و براي جداسازي ماكرومولكول ها و سوپر مولكول ها استفاده مي شود. از ژل آگارز در الكتروفورز هم به صورت عمودي و هم به صورت افقي استفاده ميشود. اين ژل را در درصدهاي مختلف تهيه مي كنند كه اين مطلب به اندازه قطعه موردنظر بستگي دارد. يعني هرچه اندازة قطعه موردنظر بزرگتر باشد غلظت ژل كاهش مي يابد و برحسب اندازه قطعه ژل آگارز را در cast 60 cc, cast 30 cc تهيه مي كنند.بطور مثال: براي قطعه اي با ميزان 100 bp از ژل آگارز 5/2% استفاده مي كنيم. كمترين درصد ژل آگارز در حدود 6/0% مي باشد.

اسلاید 58: Et.Br: (اتيديوم برومايد): شديداً موتاژن است و بسيار سمي است از تنفس بخارات آن بايد پرهيز نمود و پسمانهاي مرتبط با اين ماده بايد در داخل گالن هايي كه بر سر آنها يك قيف ايمني متصل است دفع شود. فرمول شيميايي اين ماده c21H20Brn3 مي باشد. وزن مولكولي اتيديوم برومايد Mw=394/3 مي باشد.

اسلاید 59: Loading Buffer   : تركيبات اين ماده عبارت است از برموفنل و سوكروز و فرمول شيميايي سوكروز عبارت است از C21H22O11  و وزن مولكولي 3/342=Mw  حركت اين رنگ نشان دهنده حركت محلول آن بوده يعني حركت آن علاوه بر صحت انجام كار يك شاخص براي اندازه گيري و حركت محلول در داخل ژل است .طرز تهيه Loading Buffer  :سوكروز 40% و برموفنل 25% را با يكديگر مخلوط كرده محلول حاصل Loading Buffer  نام دارد.

اسلاید 60: TBE : تركيبات اين ماده به قرار زير است. تريس، EDTA ، بوريك اسيد

اسلاید 61: روش كار: 1. پودر آگارز را وزن كرده و درون بشر يا ارلن بريزيد.2. TBE lox را كه در دسترس است توسط آب مقطر به نسبت 10:1 رقيق كرده و بدين طريق TBE lx را بسازيد.AgaroseBuffer Solution

اسلاید 62: 3. كمب (Comb) را بر روي كست (Cast) موردنظر قرار دهيد و فاصله بين Comb , Cast را 1mm درنظر گرفته وب راساس اين فاصله جايگاه comb بر روي cast را تنظيم كنيد.

اسلاید 63: 4. TBE lx را براساس حجم موردنظر توسط استوانه مدرج داخل ارلن يا بشر ريخته و به آهستگي تكان دهيد.5. محلول داخل ارلن را در داخل ماكروويو قرار داده يا بجوشانيد بطوري كه ذرات، آگارز داخل آن كاملاً حل شده و ذره اي داخل آن نباشد و محلول يكنواخت گردد. و سپس محلول موردنظر را سرد كنيد.6. به محلول درون بشر در حدود (1-2m) از اتيديوم برومايد توسط سمپلر اضافه كنيد.7. محلول را تكان دهيد تا اتيديوم برومايد كاملاً در آن حل شده و محلول يكنواخت گردد.

اسلاید 64: 8. محلول درون بشر را به آرامي درون cast ريخته و در حدود min20 صبر كنيد تا ژل آگارز بسته شود.

اسلاید 65: 9. ژل را به همراه cast داخل تانك الكتروفورز قرار دهيد و جاي آن را ثابت كنيد و سپس تانك را تا كمي بالاتر از ژل توسط TBE lx پر كنيد.buffer Cathode(negative)Anode(positive)wellsDNA

اسلاید 66: طريقه ران كردن (Running Procedure) 1. به تيوبهاي حاوي نمونه به ازاء هر 5ml از نمونه موردنظر در حدود 1ml از Loading Buffer به آن اضافه كرده و خوب Pipeting كنيد. 2. بوسيله سمپلر محتويات درون هر tube را داخل چاهك از سمت چپ به راست از ژل run كنيد و در آخرين چاهك نيز ماركر را ران كنيد.

اسلاید 67: 3. جريان الكتريكي در حدود (120v) 120 ولت به تانك وصل كنيد تا محلول run شده از چاهكها خارج شود و سپس ولتاژ را پائين آوريد و در ولتاژ حدوداً بين 80  تا 90 ولت قرار دهيد.

اسلاید 68: 4. پس از حدوداً 45 دقيقه ژل را از تانك خارج كنيد و سپس از كست (cast) تير خارج كرده و در  داخل دستگاه Gel Doc قرار دهيد.5. پس از قراردادن ژل در داخل دستگاه عكس ژل را بگيريد

اسلاید 69: آماده سازی قالب

اسلاید 70: كار دستگاه ژل داك: Gel Cod 1- ژل را از كست خارج كرده و داخل دستگاه Gel Doc قرار داده و جايگاه ژل را تنظيم كرده و درب دستگاه را ببنديد.

اسلاید 71: 2- مانيتور را روشن كرده و ازطريق مانيتور محل قرارگرفتن ژل را تنظيم كنيد.3- سپس اشعه (Ultraviolet)uv را روشن كرده تا باندها نمايان شوند.4- با كليد (+) و (-) نور را زياد و كم كنيد.

اسلاید 72: 5- وقتي باندها مشخص شد ابتدا كليد save را فشار دهيد و سپس كليد print را روي دستگاه printing فشار دهيد و عكس ژل را بگيريد.6- سپس uv را خاموش كرده و تمام دستگاه ها را نيز خاموش كرده و ژل را از دستگاه Gel Doc خارج نمائيد.

اسلاید 73: نتيجه گيري:از مقايسه باندها با باندهاي ديگر و همچنين ماركر marker و نمونه normal مي توان تغييرات و موتانتها را تشخيص داد و يا حتي وجود يا عدم وجود DNA رايتر را مشخص كرد. ايجاد باند و تأثير uv روي آن وجود DNA را ثابت مي كند

اسلاید 74:

اسلاید 75: AnimationElectrophoresis

اسلاید 76: روش اندازه گیری کمیREAL TIME PCR

اسلاید 77: Real Time PCR مقدمهواکنش های زنجیره ای پلیمراز PCR جایگاه خود را در تاریخ زیست پزشکی بعنوان یک روش انقلابی تثبیت کرده است . تکنیک های متعددی برگرفته از PCR آمده و رفته اند . از زمانی حدود یک دهه قبل ،‌که تکنیک Real Time PCR بر اساس مفاهیم متداول PCR‌شکل گرفته وشروع به کارنموده است روند رشد وتکامل آن دائم در حال رشد ومورد توجه است . با پرش به مرحله انجام کلیه مراحل PCR در یک دستگاه وتنها در یک مرحله نسبت به روش سابق که مبتنی بر مراحل بعدی پس از اتمام PCR بود. قدم بزرگی برداشته شد. Real Time PCR به تنهایی حساس ترین وتخصصی ترین روش کمی وکیفی PCR میباشد.

اسلاید 78: مفهوم Real Time PCR این است که شما قادر به دیدن نمودار در حین زیاد شدن تعداد کپی های توالی مد نظرتان در طول PCR روی مانیتور کامپیوتر بصورت حقیقتا همزمان Real Time PCR باشید .

اسلاید 79: Real Time PCR مجموعه تکراری ازسیگنالهای فلورسانت از یک یا چندین واکنش زنجیره ای پلیمراز بصورت همزمان تحت پوشش دامنه ای از سیکلها اند .اندازه گیری کمی Real Time PCR،‌درحقیقت تبدیل سیگنال های فلورسانت از هر واکنش به اعداد و ارکان قابل رویت برای هر نمونه است .

اسلاید 80: اندازه گیری کمی PCR با ایجاد یک توالی DNA  مکمل cDMAبوسیله آنزیم Reverse Transcriptase رونویسی کننده معکوس شروع شد . دو نوع آنزیم RT در بازار موجود هستند : AMV تولید شده توسط پیترز وهمکارانش در سال 2004 وآنزیم MMLV توسط ژرارد وهمکارانش در سال 1997.

اسلاید 81: کاربردهای Real-time PCR:. تعیین تعداد کپی از هر ژن: Wu, 2007; ABI TaqMan® Gene Copy Number Assays; Protocol for 7900HT2. سنجش میزان بیان ژن:Giulietti, 2001 و Leung, 20053. بررسی صحت نتایج در آرایه ها: Rajeevan, 2001 و Verification of Array Results Page by Pfaffl4. مطالعات ایمنی زیستی و پایداری ژنتیک: Lovatt, 2002

اسلاید 82: 5. بررسی میزان اثر بخشی داروها و مانیتورینگ داروها: Leruez-Ville, 2004; Brennan, 2003; Burger, 2003; Kogure, 20046. انجام تکنیک Real-Time Immuno-PCR (IPCR): Adler, 2003; Barletta, 2004; Lind & Kubista, 20057. رسوب کروماتین با استفاده از اتصال آنتی ژن-آنتی بادی: Braveman, 2004; Sandoval, 2004; Wang, 2004; Iype, 2005; Potratz, 2005; Puppo, 20058. سنجش ویروسها: Niesters, 2001; Mengelle, 2003; Espy, 2006

اسلاید 83: 9. شناسائی عوامل پاتوژن شامل:شناسائی CMV: Kearns, 2001a; Kearns, 2001b; Kearns, 2002; Mengelle, 2003تشخیص سریع آلودگی به مننگوکوک: Bryant, 2004بررسی حساسیت استرپتوکوکوس پنومونیا به پنی سیلین : Kearns, 2002شناسائی مایکوباکتریوم توبرکولوزیس و گونه های مقاوم:  Kraus, 2001; Torres, 2003; Cleary, 2003; Hazbon, 2004پاتوژن های میکروبی در آبهای محیطی: Foulds, 2002; Guy,

اسلاید 84: 10. اندازه گیری میزان آسیب به DNA: Dietmaier, 200111. سنجش میزان تماس با اشعه رادیواکتیو: Blakely, 2001; Blakely, 2002; Grace, 2002; Grace, 200312. بررسی فرآیندهای زیستی در سلولهای زنده: Tung, 2000; Bremer, 200213. مطالعه DNAی میتوکندریائی: He, 2002; Liu, 2003; Alonso, 2004

اسلاید 85: 14. شناسائی متیلاسیون: Trinh, 2001; Cottrell, 2004; Lehmann & Kreipe, 2004; Thomassin, 200415. تشخیص غیرفعال شدن ژنها در کروموزوم X: Hartshorn, 2002; van Dijk, 200216. تعیین همسانی در لوکوسهای HLA: Zhou, 200417. پیگیری نتایج پیوند عضو: Sabek, 2002; Gibbs, 200318. پیگیری نتایج، پس از پیوند سلولهای بنیادی خونساز: Elmaagacli, 2002; Alizadeh, 2002; Thiede, 2004; Harries, 200419. پیگیری عوارض باقیمانده ناشی از بیماری، پس از پیوند سلولهای بنیادی خونساز: Elmaagacli, 2002; Cilloni, 2002; Sarris, 2002; Gabert, 2003; Van der Velden, 2003

اسلاید 86: در سایت PrimerDesign کیتهای متعددی برای تشخیص عوامل پاتوژن به روش real-time PCR،  به شرح زیر معرفی شده است:Acinetobacter baumanniiAdenovirus Type BAdenovirus Type C Adenovirus Type F and G Aggregatibacter actinomycetemcomitans Aspergillus all pathogenic subtypes Avian adenovirus: Egg Drop Syndrome Avian influenza: H5N1 Bacteria Hemorrhagic Septicemia BifidobacteriumBordetella pertussis

اسلاید 87: Enterococcus faeciumEnterovirusHuman Influenza A virus Escherichia coli EubacteriaSin NombreGardia lamblia Gonorrhoeae Grass Carp ReovirusHaemophilus influenzaeAnd ….

اسلاید 88: به طور کلی دو روش برای انجام PCR کمی با استفاده از Real-Time PCR داریم:1- سنجش غیراختصاصی 2-سنجش اختصاصي شامل : Hydrolysis Probes که به سه نوع Taq man، Beacons و Scorpions تقسیم می‌شود.در ادامه توضيح خواهيم داد .

اسلاید 89: 1- سنجش غیراختصاصی: این روش با استفاده عوامل متصل شونده به DNA مثل SYBR Green انجام می‌شود. این رنگ از طریق جایگزینی در شیار کوچک DNA به DNA متصل می ‌شود.SYBR Green

اسلاید 90: از جمله مزایای این روش ارزان، راحت و حساس بودن آن است. یکی از معایب بزرگ آن این است که با اتصال به دورشتة‌هایی مثل پرایمر دایمر و دیگر باندهای غیراختصاصی، نتایج بیشتر از غلظت اصلی برآورد می‌شود و بنابراین بهینه کردن آن باید به صورتی باشد که کمترین مقدار پرایمر دایمر و محصول غیراختصاصی ایجاد گردد. به همین دلیل به این نوع از PCR واکنش غیراختصاصی می‌گویند.REAL TIME PCRUSING SYBR GREEN

اسلاید 91:

اسلاید 92: بعضي از مراحلي كه در دستگاه RT-PCRرخ مي دهد مشابه PCR است. اسلايد بالا نشان می‌دهد در واکنش RT-PCR هنگامی که DNA به صورت واسرشت (Denaturate) در می‌آید، سایبرگرین به DNA متصل نمی‌شود، اما در مرحلة Annealing و تکثیر DNA ، همزمان با دورشته‌ای شدن DNA سایبرگرین در ساختار آن قرار می‌گیرد. به این ترتیب با افزایش DNAهای دورشته‌ای مقدار سایبرگرین متصل شده نیز افزایش می‌یابد و درنتیجه نور فلورسانت بیشتری ساطع می‌شود که شدت نور توسط دستگاه قابل اندازه‌ گیری است.

اسلاید 93: SYBR Green AssaySYBR GreenSYBR GreenSYBR GreenSYBR GreenSYBR GreenSYBR GreenSYBR Green (high fluorescent conformation)

اسلاید 94: در شکل زیر نیز مکانیسم عمل سایبرگرین به عنوان یک عامل متصل شونده به DNA نشان داده شده است:

اسلاید 95: از جمله مزایای Real-Time PCR ترسیم منحنی ذوب (Melt Curve Analysis) است که پس از اتمام فرآیند PCR ترسیم و برای تایید نتایج استفاده می‌شود. دمای ذوب DNA یک پارامتر ویژه برای این مولکول است که به ساختمان آن و عواملی نظیر طول و تعداد نوکلئوتید، غلظت پروب، میزان نمک محیط و درصد GC ؟ بستگی دارد.

اسلاید 96: بعد از اینکه RT-PCR به پایان رسید، دستگاه قادر است نمودار ذوب هر نمونه را رسم کند. این کار بوسیلة اندازه‌گیری تغییرات فلورسانس در دماهای مختلف صورت می‌گیرد. مراحل انجام کار به این ترتیب است که برای رسم منحنی، دستگاه دمای نمونه‌ها را در فواصل زمانی مشخص (مثلا هر 10 ثانیه) به مقدار معینی تغییر می‌دهد. یعنی ابتدا دستگاه دمای نمونه‌ها را مثلا به 94 درجه سانتیگراد می‌رساند، در این حالت تمام DNAها به صورت تک‌رشته‌ای هستند و میزان سایبرگرین متصل شده حداقل است. در نتیجه میزان فلورسانس ساطع شده کم می‌باشد. به تدریج دستگاه دمای نمونه‌ها را 5/0 درجه سانتیگراد کاهش داده و 10 ثانیه در آن دما ثابت می‌ماند و در این مدت نور ساطع شده از نمونه‌ها را اندازه‌گیری می‌کند. همزمان با این عمل منحنی تغییرات فلورسانس بر حسب دما - که همان منحنی ذوب است- ترسیم می‌گردد.

اسلاید 97:

اسلاید 98: در این منحنی هر یک از قله‌ها نمایانگر Tm یک محصول PCR است. بنابر این با تحلیل منحنی ذوب می‌توان وجود باندهای غیراختصاصی و دایمر پرایمر را تشخیص داد. نرم‌افزار، سرعت تغییرات را به صورت Relative Fluorescence Unite یا RFU در محور y و دمای دستگاه را در محور x نشان می‌دهد.پس از مشتق‌گیری از نمودار مقابل، منحنی درجه دومی بدست می‌آید که در این منحنی هر قله نمایانگر یک محصول PCR است. قله‌هایی که در دماهای پایین‌تر هستند، نشان دهندة قطعات کوچکتر هستند.

اسلاید 99: در منحنی ذوب فوق همة نمونه‌ها بوسیلة یک جفت پرایمر یکسان تکثیر شده‌اند. نمونه‌ای که با خط قرمز مشخص شده (پایین‌ترین قله) نمونه کنترل می‌باشد که فاقد DNA الگو است و Tm پایین این نمونه نشانگر وجود دایمر پرایمر می‌باشد.در انتهای کار دستگاه با استفاده از پروب TaqMan نمودار منحنی ذوب رسم می‌شود که چند نکته در هنگام تحلیل و بررسی نمودار حتما باید در نظر گرفته شود

اسلاید 100: همانطور که گفته شد، دستگاه بعد از پایان کار منحنی ذوب را ترسیم می‌کند که محور افقی این منحنی دما و محور عمودی آن میزان فلورسنت قابل ردیابی می‌باشد و براساس این منحنی ما می‌توانیم مقدار و اندازة قطعات تکثیر شده را بسنجیم. به این صورت که هرچه میزان فلورسنت قابل ردیابی کمتر باشد، قلة تشکیل شده کوتاه‌تر است و بنابراین میزان تکثیر آن قطعه هم کمتر بوده که سایبرگرین کمتری به آن متصل شده است. اما در مورد اندازه ی قطعات، هرچه قله در دمای پایین‌تری تشکیل شود، Tm قطعه کمتر بوده و معمولا باند غیراختصاصی ما در این محدوده قرار می‌گیرد. نمودارهای زیر این مطلب را به خوبی روشن می‌کنند:

اسلاید 101: 2- سنجش اختصاصی: الف- Hydrolysis Probe Technique : این نوع از واکنش Real-Time به 3 دسته تقسیم می‌شود. در این روش از مکانیسم سیستم انتقال انرژی فلورسانس یا (FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer استفاده می‌شود در این مجموعه پروب‌ها طوری طراحی می‌شوند که در ابتدای پروب یک رنگ فلورسانس به نام Reporter و در انتهای آن فلورسانس دیگری به نام Quencher قرار می‌گیرد.

اسلاید 102: وقتی که Reporter و Quencher در حالت اتصال به پروب و در فاصلة نزدیک به هم قرار دارند، نوری که به Reporter می‌خورد، باعث ایجاد یک تابش (Emission) می‌شود که این تابش در ناحیة تحریک Quencher است، بنابراین Quencher این نور را جذب کرده و تابشی در طول موج بلندتر که قابل ارزیابی توسط دستگاه نمی‌باشد، ساطع می‌کند. اما پس از جدایی Reporter از Quencher نور ساطع شده از Reporter توسط Quencher قابل جذب نیست و توسط دستگاه به صورت فلورسانس قابل اندازه‌گیری است.Reporter Quencher

اسلاید 103: روش :Taq Man Probe اساس این روش خاصیت 5´ Exonuclease آنزیم Taq DNA Polymerase می‌باشد. در پروب Taq Man یک Reporter در انتهای ´5 و یک Quencher در انتهای ´3 وجود دارد. همچنین در انتهای ´3 یک مسدود کننده (blocker) هم وجود دارد، تا پروب به عنوان پرایمر استفاده نشود. پروب حدود چند باز بعد از انتهای ´3 پرایمر روبه‌جلو قرار می‌گیرد و طول آن 30-20 نوکلئوتید است.در این نوع واکنش PCR برایس اتصال کامل پروب، به غلظت بیشتری از  MgCl2 نیاز است. آنزیم پس از نزدیک شدن به پروب با استفاده از خاصیت اگزونوکلئازی ´5 خود، پروب را لیز می‌کند و وقتی پروب تجزیه شد، Reporter از تاثیر Quencher خارج می‌شود و فلورسانس تابش شده از آن توسط Quencher قابل جذب نیست. بنابراین در هر دوره با آزاد شدن بیشتر Reporter ماده فلورسانس بیشتری تابش شده و توسط دستگاه ثبت می‌شود.

اسلاید 104: نمودار زیر نشان می‌دهد که میزان افزایش فلورسانس Reporter با میزان محصول تولید شده ارتباط مستقسم دارد. در هر دوره با آزاد شدن بیشتر Reporter ، ماده فلورسانس بیشتری تابش ساطع شده و توسط دستگاه ثبت می‌شود.

اسلاید 105: TaqMan ChemistryRQ

اسلاید 106: TaqMan ChemistryQRRRRRRR

اسلاید 107: TaqMan ChemistryQR

اسلاید 108: TaqMan ChemistryQRR

اسلاید 109: روش  Beacones Probe:این پروب نیز همانند پروب Taq Man دارای رنگ در انتهای ′3 و ′5 می‌باشد، اما برخلاف Taq Man تجزیه نمی‌شود و در سیکل‌های بعدی دوباره استفاده می‌شود. این پروب قبل از اتصال به DNA به صورت حلقه است که به آن Stemloop structure می‌گویند.به علت نزدیکی Reporter و Quencher نور ساطع شده از Reporter توسط Quencher مهار می‌شود. پس از اتصال پروب به محل مورد نظر خود، ساختار Stemloop باز شده و در نتیجه رنگ‌ها از هم دور می‌شوند و تابش نور از Reporter انجام می‌گیرد.

اسلاید 110: Molecular BeaconsQRRQRQRQRQQRQR

اسلاید 111: روش  :Scorpion Primers توالی پروب طوری طراحی شده که مکمل تعدادی از نوکلئوتیدها بعد از پرایمر Forward است. دو طرف پروب شامل توالی شش نوکلئوتیدی است که در دمای محیط ایجاد duplex می‌کند. انتهای ′5 ساقه به صورت کووالان به Reporter و انتهای ′3 به Quencher متصل می‌باشد. هنگامی که پروب به صورت duplex است، نور ساطع نمی‌شود. یک بلاکر نیز از تکثیر پروب توسط پرایمر Reverse در چرخة بعدی PCR جلوگیری می‌کند. جهت‌گیری پروب به صورتی است که انتهای ′5 آن مکمل انتهای ′3 Target می‌باشد.

اسلاید 112: در طول چرخه‌های PCR همزمان با اتصال پرایمرها،‌لوپ پروب باز شده و به قسمت تکثیر شده از چرخة قبل متصل می‌شود و در نتیجه به علت جدا شدن Reporter از Quencher نور ساطع می‌شود. در مرحلة بعد پروب از Tamplate جدا شده و به حالت خاموش در می‌آید. به این ترتیب در هر annealing با افزایش محصول PCR مقدار فلورسانس نیز افزایش می‌یابد.شکل زیر اجزای تشکیل دهندة پرایمر scorpion را نشان می دهد،  همزمان با اتصال پرایمرها، لوپ پروب باز شده و به قسمت تکثیر شده از چرخه ی قبل متصل می‌شود و در نتیجه به علت جدا شدن Reporter از Quencher نور ساطع می‌شود.

اسلاید 113: SCORPIONSQR

اسلاید 114: SCORPIONSQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRR

اسلاید 115: TaqmanBeaconScorpionComparison of Probe Chemistries

اسلاید 116:

اسلاید 117: Optical Detection System of Real-Time PCRwww.biorad.com2a. excitation filters2b. emission filters1. halogen tungsten lamp4. sample plate3. intensifier5. detector 350,000 pixels

اسلاید 118: Quantitative PCR[DNA]Cycle #Limit of detectionCtThreshold

اسلاید 119: Linear ground phase:PCR is just beganFluorescence emission at each cycle has not yet risen above backgroundBaseline fluorescence is calculated at this timeCT - threshold cycle:the first significant increase in the amount of PCR product correlates to the initial amount of target template CT represents the starting copy no. in the original template Early exponential phase:PCR is just beganThe amount of fluorescence has reached a threshold where it is significantly higher than background (usually 10 times the standard deviation of the baseline)PCR can be broken into 4 major phases

اسلاید 120:

اسلاید 121: 3-Types of Real Time PCR Quantification STANDARD CURVE METHOD

اسلاید 122:

اسلاید 123: SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS

اسلاید 124: SERIES OF 10-FOLD DILUTIONSthresholdCt

اسلاید 125: Dilution curve reference gene‘copy number’ reference gene experimental‘copy number’ reference gene controlCCCCCCEEEEEE

اسلاید 126: APPROXIMATION METHOD DDCt EFFICIENCY METHOD

اسلاید 127:

اسلاید 128:

اسلاید 129: IL1-b vitRPLP0 vitIL1-b conRPLP0 conav =19.80av =19.93av =18.03av =29.63D Ct = 9.70D Ct = -1.7D Ct = target - refD Ct = target - refDifference = DCt-DCt= DDCt = 9.70-(-1.7)= 11.40controlexperiment

اسلاید 130: استاندارد هاي مورد سنجش در RT_PCR (Housekeeping Gene for Normalization)Commonly used standards:Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase mRNABeta-actin mRNAMHC I (major histocompatability complex I) mRNACyclophilin mRNAmRNAs for certain ribosomal proteinsE.g. RPLP0 (ribosomal protein, large, P0; also known as 36B4, P0, L10E, RPPO, PRLP0, 60S acidic ribosomal protein P0, ribosomal protein L10, Arbp or acidic ribosomal phosphoprotein P0) 28S or 18S rRNAThe perfect standard does not exist

اسلاید 131: منابع اینترنتی برای مطالعه بیشتر در زمینه Real-Time PCR1st International qPCR Symposium  &  Application Workshop, qPCR 2009ABgene Dual Labeled Probe Design GuideABI TaqMan Human Endogenous Control PlateABI User Bulletins ABI-PRISM 7700 Application Notes 7900HT 7000 CompendiumAlleleID Pathogen Detection Primer & Probe Design Tool by Premier Biosoft InternationalAmbion TechNotes on Real-Time PCRApplied Biosystems Sequence Detection SystemsAutomated PubMed Search for Real-Time PCRAvailable Real-Time PCR Platforms BioCompareBestKeeper© for determination of stable housekeeping genes, Download

اسلاید 132: مقالات منبع :در اندازه گيري بيان ژن (CRT-PCR) 1-استفاده از روش پي- سي- آر معكوس رقابتي ((قدرت ا… رحيمي2- تاثير 6 هفته تمرين استقامتي بر تظاهر ژن abca1 كبدي موش ويستاز بهزاد مهدي خبازيان-دكتر عباس قنبري نياكي-دكتر فاطمه رهبري زاده –دكتر سيد عليرضا حسيني كاخك-مهدي جباري نوقانياينترفرون گاما mRNA 3-تعيين نيمه كمي ميزان بيانRT-PCR با استفاده از روشدكتر جليل توكل افشاري* ، عليرضا زماني** ، دكتر جواد بهروان*** ، دكتر بهروز شيشه ئيان ****تبيتا سيفي*****PCR 22 با روش q 4-شناسايي ريزحذف هاي 11.2(SQMPCR) نيمه كمي چند گانهسارا پورانوري 1، مهرداد نوروز ينيا* 2، عل ياكبر زينالو 3، سعيدرضا غفاري 4، مسعود هوشمند 5، سعيد كاوياني Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCRRui Shi and Vincent L. ChiangNorth Carolina State University, Raleigh, NC, USABioTechniques 39:519-525 (October 2005)doi 10.2144/000112010

اسلاید 133: Thank U4 Leiseing