واکنش زنجیره ای پلی مراز

صفحه 1:


صفحه 2:
بسم اه الرحمن الرحیم واکنش زنجیره ای پلیمراز : مخترع واکنش ۳6 گری ‎dhs 92 48 286 Gs (Kary Mullis) ols‏ 49 اين روش را ‎See‏ تکثیر ‎US Gis DNA‏ * قبل از این کشف» ساخت قطعات 201۸] با روش های کند و پر هزینه شیمیایی انجام می گرفت. »به دليل اهمیت این اختراع» کاربردهای فراوان و نقش ارزنده آلن در پیشرفت علم ژنتیک و زیست شناسی مولکولی؛ وی جایزه توبل شیمی را در سال 196 دریافت کرد. 

صفحه 3:
واکنش ‎PCR‏ به طور روزمره در اکثر آزمایشگاه های تشخیصی و تحقیقاتی استفاده می شود و در موارد بسیاری مثل : شناسایی و جداسازی ژن ها کلونینگ طبقه بندی و شناسایی موجودات زنده تشخیص بیماری های ژنتیکی و حتی پرونده های جنایی و تعیین هویت کاربرد دارد. 

صفحه 4:
استخراج ماده ژنتیکی اولین قدم در مهندسی ژنتیک جداسازی با خالص سازی ۱۱۸ و 8108 می باشد. که این کار دارای مراحلی است که عبارتند از : 0) شکستن سلول ءسلول های حیوانی(شوک اسمزی- سدیم دودسیل سولفات) سلول های گیاهی (پکتیناز و سلولاز) *باکتری ها با توجه با گرم مثبت یا گرم منفی ‎RNA > DNA wh oss (C‏ : *الکل سبب تجمع و رسوب ماده ژنتیکی می شود. 9) جدا کردن ‎RNAs DNA‏ <) رسوب پروتنین ها : (استفاده از فنل و یا محلول های غلیظ نمک های مختلف) 9) جداسازی 0۱۸ و 8۸۷۸۵ از یکدیگر: (استفاده از 0۱156 و ‎(RNase‏ ‏)رسوب ماده ژنتیکی با اتر «) اسپکتروفتومتری:(جهت تایید استخراج) 

صفحه 5:
205 يا واكنشززنجيره اويليماز ‎(Polymerase Chain Reaction)‏ تكنيكى است كه با استفاده از آسن مى توان در مدت زمان کوتاهعی قطعه خاصی از مولکول ‎DNA‏ رادر شرايط آزمایشگاهی میلیون ها بار تکثیر نمود. * اين قطعه 01148 ممكن است: * یک ژن بخشی از یک کروموزوم یا بخش هایی از ژنوم یک موجود باشد. 

صفحه 6:
* اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی ‎DNA‏ در موجودات زنده توسط آنزیم ‎DNA‏ پلیمراز صورت می گیرد. در موجودات زنده, مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی /2] نقش دارند در حالی که در واكنش ‎PCR‏ تنها نوع خاصی آنزیم 2] پلیمراز مقاوم به حرارت به نام 00۱/۲۳6۲856 ۲320 به همراه بافر كلريد منیزیم و نوکلئوتیدها جهت تکثیر قطعات 00۷] استفاده می شود. 

صفحه 7:
ساز و کار (برنامه ‏ واکنش ‎PCR‏ اساس واکنش ‎PCR‏ جهت تکثیر توللی ‎DNA‏ 32 ۳ باشد. در ابتدا پیوندهای هیدروژنی دو رشته توالی ۸ 3 درجه سلسیوس) شکسته و دو رشته از ‎ie‏ دملیی می رارت (50-914 * ميس دمائ | كفن ده می شود (معمولاً ۵۰ تا | يجا #اللسيوس). در لين مرحله ‎I,‏ رز رشته ای (معمولاً بین ۱2۱۸ ۳۰ نوکلتونید) که ‎shy ib ayy DNA aki Gib 5 ada lids‏ 5 ء ‎OS‏ به توالی های مکمل خو در ردو رشته با VL sel, eb ‏اند (با‎ BNA‘ ats Ceri ‏لین دو قطعه انتهای‎ 2S 4 jes DNA پلیمراز از را فراهم می نماد ۰ کاری که در هملنند سازی ر موج ات زنْدة توسط أنزيم يريماز و ثوال وليه سات شايع ترهظا 0 نجام مى كيرد * در مرحله بعد» دمای واکنش تا ۷۲ درجه سلسیوس (دماء ‎Taq‏ اسب آنزیم ‎‘polymerase‏ افزایش یافته و عمل تکثیر قطعه ‎BNA‏ مورة:نظر بين دو بس اسستفاه از وکلونید‌های موه توسط آنزیم 80 ا مقاوم به حرارت انجام می پذیرد. 

صفحه 8:
DNA IN THE CELL NUCLEUS 

صفحه 9:
DNA STRUCTURE DEOXRIBO NUCLEIC ACID DEOXYRIBOSE 

صفحه 10:
DNA STRUCTURE Db. bb 2 P = PHOSPHATE 

صفحه 11:
DNA STRUCTURE Pee fy BASE BASE BASE BASE BASE Cc G 1 BASE = cytosine adenine thymine guanine 

صفحه 12:
DNA STRUCTURE ۳ ۸ 

صفحه 13:
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 

صفحه 14:
Denature DNA by heating 

صفحه 15:
Primers (short pieces of DNA) bind to specific parts 

صفحه 16:
New DNA made by DNA polymerase + subunits of DNA 

صفحه 17:
New DNA made by DNA polymerase + subunits of DNA 

صفحه 18:
repeat cycling 

صفحه 19:
0 

صفحه 20:
30 - 40 cycles of 3 steps : (ies oo ‏جص‎ 1 minut 94 °C از 1 1 7 1 ۱ ۲ ‎T‏ ‏3 1 الا ری ملس ‎seconds 54°C‏ 45 حفن 5 5 2 forward and reverse 3 primers ! 211 :3ه :1 ‎a‏ ‏۳ اب ۸ 2 0 ‎minutes 72 °C‏ 2 ع او[ ند ۲ ‏م‎ ~ ۱ Tm ‏یج‎ te lal hs sin 

صفحه 21:
POR wanted gene th cycle S< SS Isteyele template DNA é =< جح ی تست ار در وا موه نومه ‎2copies‏ 

صفحه 22:
GOO «(Denaturation) ‏مرحله اول: واسرشت سازبی‎ ait OO عمل انجام شده در این مرحله: جدا شدن دو رشته ‎DNA‏ ‎«(Annealing) Jai) :a53 als ys‏ 00 تا 000 تانیه عمل انجام شده در این مرحله: اتصال پرایمرها به نواصی مکمل روی 2۱/۵] و تعیین محدوده تکثیر قطعه ۲2۱۱۸ مرحله سوم: كسترش (100أ5معغاع يا م3610 ومماع)» به ازاى هر (00(0(0 نوكلئوتيد طول قطعه (0© ثانيه ‏عمل انجام شده در اين مرحله: تكثير قطعه .//[01(] مورد نظر اين © مرحله بين ©© تا ۳00 بار تکرار می شود که به آن چرخه های ۳۳ می گویند. 

صفحه 23:
دعررة ورأمم اعت قات Tess) oleh a>} 

صفحه 24:
اجزا واکنش ۳۹ در یک واکنش ۳0۳ از: DNA 43543 * sunt Taq polymerase ‏آنزيم‎ « Primers (UM 2.0 - 0.1) Bole ‏بافر‎ * DNA template mM 5 - 1) ) ‏»يون منيزيم‎ moc, (UM 250- 20) ‏نوكلئوتيدها‎ ٠» ‏آب نوكلئاز فری‎ + 

صفحه 25:
(811) DNA 43 53 * < 0.1 ng plasmid DNA, 50 ng to 1 yg gDNA for single copy genes ۱20۱۸ ‏قطعه ای از‎ محصول استخراج /20۷] ژنومی پلاسمیدی یا حتی محصول ۳:۳ از یک واکنش دیگر 

صفحه 26:
معمولاً حدود یک نانوگرم از 080۵ پلاسمیدی یا فاژی یا یک میکروگرم از 201۵ ژنومی برای یک واکنش ۳ کافی است. بيش از لین مقدان باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات ۸ دیگری غیر از قطعه مورد نظر)می شود . مقدار کم نمونه 0۷۸ نیز باعث کاهش دقت واکنش ۳0 یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد کیفیت نمونه ۵01۸ نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج 901۸ مثل فنل و ‎EDTA‏ باعث كاهش فعاليت أنزيم 6 20[ و عدم حصول نتیجه مورد نظر مى كردد همجنين آلوده شدن واکنش ۳68 با مقادیر بسیار اندک 901۸ از مب ‎es‏ دلیل حساسیت فوق العاده این تکنیک ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد. 

صفحه 27:
Taq polymerase «31 - لين آنزيم براى تكثير قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده و پر مصرف ترین آنزیم مورد استفاده در *آ) می باشد. - اگرچه دمای مناسب برای این آنزیم ۷۲ درجه سلسیوس می باشد ولی چون این آنزیم در دمای معمولی نیز قادر به تکثیر می باشد برای جلوگیری از اتصال قطعات پرایمر به نقاط دیگری روی توالی نمونه 21۸] و امکان تولید قطعات غير اختصاصىء توصیه می شود که تمامی مراحل آماده سازی واکنش ‎PCR‏ بر روی یخ صسورت گیرد. 

صفحه 28:
نوکلئوتید ها چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعه 90۸۵] از اجزا واکنش ۳6 می باشند که به عنوان واحد های ساختمانی مورد نیاز در ساخت قطعه ‎DNA‏ استفاده می شوند. غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلنوتیدها برای واکنش ‎PCR‏ ‏یکسان و برابر 00000 نانو مولار می باشد. برای این منظور از خلوط های آماده واجد هر چهار نوکلنوتید که با غلظت های مختلفت مثل دو میلی مولار» 100) میلی مولار و 060 میلی مولار موجود است» استفاده می شود. به طور مثال» در یک واکنش 600 میکرو لیذ کرو لیتر از مخلوط دو میلی مولار نوکلنوتب ‎ne he 1‏ تفاده کرد. 

صفحه 29:
. ab - مهمترین نقش بافر. ‎PCR‏ تنظيم 11م مناسب واكنش +501 و آنزیم 00۱۷۲۱6۲۵56 120 می باشد. - اجزای اين بافر نقش های دیگری نیز دارند از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به ‎SUS (45523) SU DNA‏ می کند. 

صفحه 30:
۱ 1,5 2 3 يون منيرزيم 4 5 | | — ب ۳۹ * یون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش :)۴ می باشد. * اين یون برای اتصال پرایمر و قطعه 90۷۸۵ لازم است. ۰ برای تکثیر با 00/۷۳۱6۲۵56 ۲20 اين یون عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم در واکنش :)۳ استفاده می شود. 

صفحه 31:
غلظت بهینه یون منیزیم در واکنش ۳ یک تا چهار میلی مولار است. غلظت بالاتر از این مقدار باعث تکثیر قطعاتی غیر از قطعه مورد نظر. (قطعات غیر اختصاصی) شده غلظت يايين اين يون نيز ممكن است به كاهش كارايى واكنش و ميزان توليد قطعه مورد نظر منجر شود. 

صفحه 32:
پرایمم‌ها غلظت بهینه پرایمررها برای و اکتش ‎٩‏ از 10000 نانو مولار تا یک میکرو مولار متغییر است. غلظت بیش از اين؛ منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود. طول معمول برايمرها : 00۳-16 باز باشد. ۸ بين ©© تسا 9©9© درجه سانتی‌گراد مناسبلست تفاوت 71/4 پرایمرها حداکثر 63 درجه سانتی گراد باشد . بهتر است آغاز و انتهاى برايمر با يك يا دو باز يورين آغاز و خاتمه يابد . برايمر ها 8/356 شوند .(جلوكيرى از دايمر)(بررسى اختصاصيت) فرمول محاسبه 7080 6+0(4) +۳2( ب۸)-۲۳ بهترین دمای انلینگ (6-6 درجه کمثر از 704 است . 

صفحه 33:
QOetioy ‏م2۰‎ : Doo — the tewpercure ot whick kdP the OO® strands Deo is choranterisiios oP tke DOO voxwposiivd, Wicker 05+00 voateat DOO kes a higher Do due to wore W bo«rds. 

صفحه 34:
Internal Structure Hairpin Self-Dimer ۳ Dimer و سم و 3 Gocaaa: ۱۱۱ ۷ sewers rer mi’) اتید و مسبت ‎rene wer‏ 5 متسه ‎uu‏ موه و ومس مه و ۱ ۴۹۳ ‏ليجع عمد جد 5 

صفحه 35:
وسایل مورد نیاز بر‌ای واکنش ‎۳2٩‏ حداقل وسایل مورد نیاز برای انجام واکنش ‎SPCR‏ ‏دستگاه ترموسایکلر میکرو پیپت ظرف يخ وسايل يكبار مصرفى : مانند تيب » ويال و ظروف نكهدارى آنها مى باشد . 

صفحه 36:
نکاتی در رابطه با تهیه واکنش ۳ نگهداشتن ویال بر روی بخ در طول زمان افزودن اجزاء واکنش و مخلوط کردن آنها. تهیه واکنش در زیر جریان هوای یک هود لامینار استریل (درمواردی كه در محل آزمايشكاه ازنوع .8104 الكوى مورد نظر كار ما زياد استفاده مى شود) بهتر است ابتدا آب واكنش در ويال كوجك ريخته شود. به حدلقل رسائدن شلنس اتصال يرايمر به 9104 (ترجيحاً 01۸ الكو آخرين افزودنى قبل از آنزيم باشد) * افزودن آنزيم يليمراز به عنوان آخرين ماده واكنش. 

صفحه 37:
PCR PROCESS > Denaturation 15 Sec- 2 min 95C > Annealing 30- 60 Sec 40- 60 © > Extension 1-2 min 72 © 

صفحه 38:
Verification of the PCR product on gel ladder PCR fragments 

صفحه 39:
غلظت پرایمر نیلی زیاد است. دمای ۸۵۱062۱1۳0 پائین است خصوصاً در سیکل‌های اول دمای پائین ۸۲۱۳۱۵۵۱۱9 سبب اتصال غیر اختصاصی پرایمر به الگو می گردد. می توان غلظت یون منيزيم را کاهش داد غلظت 08۲۳۴ خیلی بالا است. دناتوراسیون 21۸ الگو بطور کامل نیست. زمان سیکل‌ها را می‌توان کمی کاهش داد. سرعت ۲/۱۳ خیلی کند است. گاهی انجام یک واکنش ۹ ‎NESTED‏ باند اضافی را حذف می‌کند. بریدن باند مورد نظر از روی ژل آگارز: تخلیص آن و سپس ۷ آن نیز توصیه می‌گردد. * دلطراحی‌ا رایس اتکال] بوده است. 

صفحه 40:
انواع روشهای ۴ مالتیپلکس پي سي ‎Multiplex-PCR)) J‏ : - یکی از روش‌های تغییریافته ‎01٩‏ است که در ن با استفاده از پرایمرهای مختلف می‌توان چندین جا را مورد بررسی قرار داد و از چندین جفت پرایمر اختصاصی جهت تکثیر استفاده می‌شود. کاربردهای این روش می‌تواند شامل موارد زیر باشد: ) بخش‌های بزرگی از یک ‎(Gas) DNA‏ جهت جست‌وجوی تغییرات می‌تواند تررتتی سنوی ۲) بخش‌های غیرمربوط به هم در ژنوم هدف می‌تواند مورد آزمایش واقع شود. ۳ می‌توان از طریق این روش با پرایمرهای مختلف به جست‌وجوی عوامل مختلف پرداخت. مانشد شناسایی عوامل شایع مننژیت. اینن روش برای شناسایی جایگاه‌هایی از ژن‌ها به کار می‌رود 3 انواع زیادی از جهعش در آنها به وقوع ‎es‏ 

صفحه 41:
:۰ بوسر زمانیکه بیترین شرایط اتصال فراهم شود باندهاي غیر اختصاصي ممکن است قبل از انجام اولین چرخه ۳00۱ ایجاد شود حتي تا وقتي که دماي لوله ها تا(060-26 درجه سانتی گراد افزایش مي یابد اتصالات غیر اختصاصي پرایمر/پرایمر و پرایمر/ الگوممکن است بوجود آید و بعنوان سوبستراي اولیه براي 00060)پلیمراز عمل كند. ساده ترین روش براي جلوگيري ازچنین اتصالات اولیه غيراختصاصي و بهترکردن شرایط اتصال صحیح پرایمر استفاده از روش +« بسرل" است که اساس این روش بر جدا کردن مواد واکنش تا زمان رسیدن به دماي بالا مي باشد. يك يا جندماده قبل از رسیدن به دماي بالاتر از 6200 درجه سانتی گراد از واکنش جدا مي شود و پس از رسیدن به دماي بالا در واکنش وارد مي کنند. روشهای جداسازی : 

صفحه 42:
POR Red trv . ‏-اين روش کمی است‎ ‏در این سیستم يك ماده فلورسانت در طي واکنش متناسب با میزان محصولات هرسیکل آزاد میشود و میزان‎ - فلورسانت ن توسط دتكتورشناسايي وثبت میگردد و بدین ترتیب میزان 0)069)تکثیر شده طي يك چرخه تا چرخه بعدي را میتوان اندازه گيري کرد. - میزان محصول در هرچرخه قابل رديابي است در حالیکه محصول روشهاي سنتي پس از پایان واکنش و الکتروفورز مشخص میشود. روشهاي سنجش با ۳06۲ ‎Red oe‏ 2 0- استفاده از رنگهاي فلورسنت مثل سایبرگرین:همزمان با دورشته اي شدن 06(69) سایبرگرین به شیار کوچكد 0069)متصل میشود و با جذب طول موج 000نانومتري؛ نور 66060 نانومتري را ساطع میکند. با افزایش مقدار محصول 3)(6هرنگ بيشتري متصل میشود و میزان فلورسانس افزایش مي یابد. پس میزان فلورسانس متناسب با مقدار 000009 دو رشته اي در واكنش است اما مهمترين عيب أن اتصال به دو رشته هايي مثل پرایمردایمر و دیگر باندهاي غيراختصاصي است كه باعث مي شود نتايج بيشتر از غلظت اصلي برأورد شود. استفاده از بروبهاي فلورسنت:يروبها برخلاف سايبركرين بر اساس تشخيص اختصاصي توالي محصول كار 

صفحه 43:
(RT-PCR) I ‏آرتی - پیسی‎ - به خاطر اینکه آنزيم /211] پلی مراز به 0/۷۸] دو رشت ای براء دارد» لذا بایستی ابتدا ‎cBNA comple mentary DNA) VERNA‏ ‎DNA‏ ا- مکمل- تبدیل کنیم . - این روش مك داری معکوس : معروف است که مادةآولیه در آن ‎CRNA‏ اون مرحله عرای روش جدیل 9۸ به ‎DAS CDNA‏ تسخهپردان ‎ARTE oy AMS‏ RNA 51 gs ole g5 SIRNA cla eg es Sl ‏برخی از موجودات مانند برخی‎ - ساخته شده است. داری نیاز کاربرد این کشف نزیم بهدليل آنكه آنزيم به حرارت حساس بود در ابتدا بايين بود ولي يا ‎eal os‏ دی ۳ يلوسر "بك ‎ath) Ses je DNA‏ یافت که در رحضور ‎N42 Se‏ دارای فعالیت نسخه بهبود ی اس ‎yea‏ ‏در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد توسط لين آنزيم از روی ‎BWA RNA‏ 2 ‎ues‏ 2 ضافی توسط اتبلن گلیکول تتراستیک اسدي (63۲۸) حذف می‌شود و سپس این آنزیم از ‎“IDNA‏ که خود ساخته استفاده و آن را تکثیر می‌کند. 

صفحه 44:
آرمز پی‌سی‌آر ۲۱ ۳- ۸۵۳۱/5 ) - این روش تکثیری قدرتمند برای مشخص کردن جهش‌های نقطه‌ای است. - در این روش از پرایمرهای جهش يافته و طبیعی در دو لوله جداگانه استفاده می‌شود. - اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر طبیعی انجام شود. نشان‌دهنده نبود جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است و اگر عمل پلیمریراسپون در لوله حاوی زمر جهش یافعه انجام وه نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است. 

صفحه 45:
نستد بوسيآر ‎(Nested-PCR)‏ در این روش از دو جقت پرایمر استفاده می‌شود طوری که جفت دوم در بین جفت اول جای روش ابتدا پرایمر بیرونی توللی هدف در طول ۱۵-۳۰ چرخه تکتیر مي‌شلود» سپس محصول به لولهاى ديكر منتقل مى شود و ‎ae‏ وبا استفاده از جفت پرایمر داحلی 2 انجام شده و ترادف کوچکتری از 2/1] که درون ‎PER‏ اولی است. به ادا ۰ تسس سس می‌شود. ابن روش تغییر یافته 2621 عبارت است از: نیاز به تأییدهای بعدی کمتر است. حساسیت در این روش به میزان زیادی بالاتر است * به دلیل انتقال محصول :)0 دور اول به لوله جدید. ممانعت کننده‌ها رقیق می‌شود. اين روش در تعيين جنسيت جنين در سه ماهه اول بارداری استفاده شده و از اين طريق توانسته‌اند بیماری‌های وا بن کرده و از تولد کودکان يمار جل وكيرىٍ همچنین ویروس 1 ‎hp ss‏ سیب ناشتوایی در از کودکان شود تو شده و امکان درمان زودهنگام از این طریق امکان‌پذیر است: در ها در مرحله بارداری مادر با این روش تشخیص داده شدند. 5 مبتلا به سندووم داون 

صفحه 46:
ELECTROPHORESIS SAAS 

صفحه 47:
ELECTROPHORESIS SAAS 

صفحه 48:
ELECTROPHORESIS SAAS 

صفحه 49:
ELECTROPHORESIS SAAS 

صفحه 50:
0 9.3 gNa,EDTA 0 oy Pee Soe ee ear 2040 ‏او‎ 05 ۱۱۵,0۲۵ (pH8.0) Repo ۴ (85% ) Cea ne (pH8.0) el [Recipe for 1 liter of 10x buffer [Components (1x buffer) ECan reac tn] 2mMNa,EDTA انام ) ‎CTs‏ ‏)7.6 ‏رت سرا اسان الس 

صفحه 51:
% Agarose DNA size range (bp) 

صفحه 52:
AL: Allele ladder CS: Crime Scene |A: Suspect A 7B: Suspect B C: Suspect C D: Suspect D a’ 74 52 7-2 10-3 © genotype BXPO07 alleles 

صفحه 53:
ELECTROPHORESIS Cathode (—) DNA and RNA are t negatively charged; they RUN TO RED! +, x. + Anode (+) 

صفحه 54:


صفحه 55:


صفحه 56:
OOO Cte Prow Oyaver Bel Ckvrophorests: Oowpaes وله داد مننصج! ذا 0000) موی ‎Lambda DNA cut 1 kb ladder‏ ‎Lambda DNA with Hind 11 3‏ ‎١ 101 100 bp ladder‏ ‎bp — 6,018 bp‏ 23,130 ‎bp‏ 1,500 ‎bp 3,054 bp 1.000 6p‏ 9,416 ‎bp ~ 600 bp —‏ 2,036 9 ‎bp 1,636 bp ‘Bit‏ 4,361 ‎bp ate bp‏ 48,500 ‎kb)‏ 48.5( ‎bp‏ 100 ‎bp —‏ 2,322 2,027 bp > 517 bp 

صفحه 57:


صفحه 58:


صفحه 59:


صفحه 60:


صفحه 61:


صفحه 62:


صفحه 63:


صفحه 64:


صفحه 65:
ح سس باتشكر فراوان . 8|802 پایان