cellculture biochemp

صفحه 1:


صفحه 2:
Introduction Cell culture is the process by which prokaryotic, eukaryotic or plant cells are grown under controlled conditions. But in practice it refers to the culturing of cells derived from animal cells. 

صفحه 3:
Basic factor in cell culture technology 1. First development was the use of antibiotics which inhibits the growth of contaminants. 2. Second was the use of trypsin to remove adherent cells to subculture further from the culture vessel 3. Third was the use of chemically defined culture medium. 

صفحه 4:
Cell culture Terminology Tissue culture: in vitro cultivation of organs, tissues & cells at defined temperature using an incubator & supplemented with a medium containing cell nutrients & growth factors is collectively known as tissue culture Organ culture:a three dimensional culture of un disaggregated tissue retaining some or all of the features of the tissue in vivo Primary explants: Derived from an explant, directly from the animal Usually only survive for a finite period of time Involves enzymatic and/or mechanical disruption of the tissue and some selection steps to isolate the cells of interest from a heterogeneous population (frog /tissue regeneration) chicken in egg / transgenic mics /tumor cell Different types of cell grown in culture includes connective tissue elements such as fibroblasts, skeletal tissue, cardiac, epithelial tissue (liver, breast, skin, kidney) and many different types of tumor cells. Histotypic culture 

صفحه 5:
Verwiewloup ‏د مجان‎ popatatiog derived Prow a singe cell Gub-cuhure ‏اه موه‎ cells Brow vor vessel to cater Cstabished or Ovatiaune Ord Lives : 4 ® preoary mule thot har beoree exon due 7 soe ‏روص‎ ©. Ost panoply ‏ناوخ و راخ مج‎ a vines suck oF ‏و6‎ 9. Ove oP the wet omer wed cele ore Chinese Werster Ovary vel (C10) @. Dke GA-8Y-GY cal a human weurvbhetrara dened elt he assur ‏ات ات‎ of surcessive sub-nikures Pro prima ‏له‎ 

صفحه 6:
Areas where cell culture technology is currently playing a major role : 1. Model systems for: Studying basic cell biology, interactions between disease causing agents and cells, effects of drugs on cells, process and triggering of aging & nutritional studies 2. Toxicity testing : Study the effects of new drugs 3. Cancer research: _ Study the function of various chemicals, virus & radiation to convert normal cultured 4. Virology : Cultivation of virus for vaccine production, also used to study there infectious cycle. 5. Genetic Engineering : Production of commercial proteins, large scale production of viruses for use in vaccine production e.g. polio, rabies, chicken pox, hepatitis B & measles 6. Genetherapy: Cells having a functional gene can be replaced to cells which are having non-functional gene 

صفحه 7:
ح‌مممرلد) Grady oF ‏امه و وه نا نون لا نات مرو الم‎ Soto oP the orouth evinced ‏جامد خاج رونت و0 مها‎ Okorunteristics oP cells coo be woiutciced over severd yeurndivas, ‏لكوي صا وعمسا‎ reproducibly betverd experieus Cwltures coo be exposed to reageds ex. codio-chewiods or drugs of dePiced ‏مه وه‎ ‎th voids the legal, word oad ethicd problews of aciczot‏ رام امه مس متا 

صفحه 8:
جهن رلمیز) ۱ ‏جا جعنيوتحادها لجولسولمواك‎ prer to woictai Keats ‏ان حارط وه‎ Por Pxpertveus ٠ ‏مهوت وا و جوز وولو‎ teckoique * Quontity oP waterial is kevited * OedPPercutaticg cad setectioa cot pour urd woop oF the origicd ‏نموه واه‎ vot be lost 

صفحه 9:
محيط كار استريل برای انجام کارهای مربوط به کشت سلول باید تا جایی كه امكان دارد يك اتاق جداكانه در نظر كرفته شود. این اتاق باید عاری از هر گونه شلوغی بوده و در صورت امکان از یک تهویه هوای فیلتر شده در محیط کار برخوردار باشد. یک فیلتر هوای ‎HEPA :High Efficiency Particle Air)‏ ۴۲ ) می تواند چنین محیطی را فراهم آورد بافت اولیه حیوانی و میکروارگانیسم ها نبید در نزدیکی آزمایشگاه کشت سلول کشت شوند و باید یک ایشگاه جداگانه و اختصاصی برای کار کشت سلول به صورت استریل طراحی شود. پوشش های مخصوص آزمایشگاه کشت سلول باید در ورودی آزمایشگاه پوشیده شده و لباسی که از این محیط خارج می گردد نباید مجدداً وا در صورت نیاز به استریلیتی شدید یک هود لامینار جهت حفظ بهتر از شرایط استریل پیشنهاد می گردد. در صورت استفاده از یک ماده شیمیایی خطرناک باید از هود های ورتیکال یا عمودی استفاده گردد. تمام سطوح كارء ميز ها و قفسه ها و هود لامينار بايد به طور مرتب با اتانول 9672/0 یا یک پاک کننده به درستی پاکیزه و استریل گردند. در صورتی که هود لامینار یا فیلتر های هوا در محيط كار وجود نداشت کار کشت می تواند بر روی یک میز تمیز با کمک شعله آتش جهت استیل نمودن سطح کار و هوای اطراف آن انجام گردد. 

صفحه 10:
Design and equipment for cell culture laboratories laboratory design: ideally divided into two areas: * an working area reserved for handling of new material (quarantine area) * an working area known to be free of contaminants (main tissue culture facility) 1. ideally, tissue culture is performed in a facility specially designed for and exclusively devoted to this kind of work. 2. - all new material should be handled as ‘quarantine material’ until it has been shown to be free of contaminants. 3. - all work surfaces should be cleaned between activities 4. - the potential danger of the cell material used may require additional considerations (such as the type of work surfaces and flooring, the type of microbiological safety cabinet, provision of air pressure negative to corridors) 5. see guidelines for handling of different kinds of cell material 

صفحه 11:
۳ ۳/۲ Worizcotd Lecvicar Plow Oubiaets hese provide the covet sterile eavironedl Por the ols, bu oPRer a pericarp ‎air ecters of the back of the cable ocd i directed to the Prost,‏ لا ‎he opercior‏ رام ‎Dke wost sterte pod oF the cobicet is of the back 

صفحه 12:
Microbiological safety cabinets RTs ATTA | AVY 

صفحه 13:
۳ ۳/۲ Chose 11 Cabinets hese robes ore desiqued to jue opercior proevioa as well or a sterde ‏و‎ he ‏اس بط خأن جما با مت طل مرو لس و وه‎ he bose, hes workieg ia hese coblarts iis keportat ol to pas umesierie objects Durer storie oes @ernee ae deo draw ts Pro the Broo of the cobicet, his are ty oot ster Oe cractcia dl our cal ‏اه ۲ هم‎ Oost work wikk Waroas or Private cols ‏وا و سب اس‎ 1 Pinter 

صفحه 14:
۳ ۳/۲ متسه ‎area whick oe rePrigercted‏ هه هه رد موه و و ۰ ۰ ‏نو مورا‎ vel ‏نی‎ be ceoPuges ia sedied rotors * ADO ‏و لا و‎ ty seckorat cols, higher 9 Porces ‏ددمل رو‎ ort: ٠ IP atube breaks fo he oeotPuge, take the whole bucket toto ‏اه ای و‎ clear it there 

صفحه 15:


صفحه 16:
Cquipweut (ecubdiors 8 Dke tubators rua ot OPO und G% Carbon Oiraide to keep the ‏با امه سا هط‎ ۰ ‏رو‎ ol have weters oo thew i reqster iewoperctune ond gar level ° Dhere oe chines to iio wheo hese device Prow set parrots ۰ Keep the door oped Por os short a ike os possible 

صفحه 17:
وسایل انکوباسیون 

صفحه 18:
ميك روسكوب از آنجا كه كشت در فلاسك هايا يليت ها انجام مى ‏ * گیرد؛ يك ميكروسكوب نورى معكوس مورد نياز خواهد بود. تشخيص تغييرات مورفولوزيكى در هر كشت بسيار حياتى است جرا كه اين مى توائد اولين انشانه ايجاد فساد در يك كشت باشد. يك ميكروسكوب نورى بسيار ساده با بزركتمار 00» براى كار روزمره شمارش سلولی کافی خواهد بوده هر چند میکروسکوپی با کیفیت بهتر برای آنالیز های کروموزومی یا کارهای رادیوگرافی خودکار مورد نیاز می باشد.میکروسکوپ معکوس همچنین برای بررسی فلاسک ها و پلیت های چند خانه از قسمت زیری هر ظرف به کار می رود. هر دو نوع ميكروسكوب بايد مجهز به لنز هاى (00* و ‎KOO.‏ بوده و براى ميكروسكوب هاى معمولى لنز های ‎XPD‏ 60060« نیز کاربرد دارند. تجهیزات ۰ اضاقی از جمله دوربین؛ دوربین ویدئویی نیز برای 1۷ آدپتور و ملزومات دیگر و امکانات اهداف دیگر مورد نیاز هستند 

صفحه 19:
Cell Culture Curwies ] ~ID-SO tkoey Poster fos wexexrakas oll, which toe ~O-IO) hue & dude. Phey ore wore wkerut i vortices ka ewpercturs, pL ‏.ايت عدجا اروصت سحي لجن‎ یه سا امن لح ‎pept echo by‏ سح مایت جاور وا ‎Orly one weet ulkerdde‏ 0 ‎coc ead ty the developer oP cxtbivtc revistat waor-pr erty.‏ وا[ ‎Orly ore wore secant ty ‏وه میس و وال‎ ‎+ hea hey hove bevu oireoord oer recovery Pro bevel croc ‎6 Oreo orb ore ‏هي مان‎ by eeaywaty derupiva cad ‏امس مایت‎ ‎+ Oden prepared Prow hve cic wl oPted be asaxepanted by waro-oreprar ‎+ Opler eels oltee bids a dhites cas dow wrens to decotcate thee ovkre ‎+ Only rekee Ouboree gnu Pertors whick ooeioa ke ween ued Pavour cell grows ‎19 

صفحه 20:


صفحه 21:
Substratwmor Substrate (for anchorage dependent cel(s) * culturevessel *GCass or Plastics * Polystyrene (gamma ray treated) *Polyvinyl chloride * Polycarbonate *Polytetrafluoresthulene 

صفحه 22:
۰ ظروف یکبار مصرف پلاستیکی جهت انجام کشت انواع مختلفی دارند. اما معمول ترین آن ها ظروفی از جنس پلی استایرن می باشد. اگز چه تمام ظروف پلاستیکی یکبار مصرف برای کشت سلول باید به اندازه کافی رشد سلولی را فراهم آورند» اما حصول اطمینان درايك ظرف جديد هم قادر به رشد است يا خير ضرورى به نظر مى رسد. آزمايشاتى كه در اين راستا صورت مى كيرند. شامل منحنى هاى رشد و زمان رسيدن به يك لايه بي سلولى مى باشد. سلول ها می توانند د يترى ديش هايا فلاسك هابى نكهدارى ی شوند كه مجهز به يك سرى امکاناتنده از جمله اينکه می توان فلاسک ها را با 02) گازدهی کرده و سپس آنها را محکم بسته ( غیر قابل نفوذ)» به طوریکه نیاز به استفاده از انکوباتور 2 مرتفع گردد . این حالت خصوصا زمانیکه انکوباتور به خوبی کار نمی کند مفید خواهد بود. ظروف کشت سلول همیشه متناسب با روش کار انتخاب می شوند.گاهی ممکن است تعویض یک محیط کشت مصرف شد. با یک محیط کشت دیگر ضروری باشد. انت اب ظرف به جندين عامل بستكى دارد: آيا كشت * در یک سوسپانسون است یا کشت به صورت تک لایه می باشد؟ عملکرد سلول» آيا كشت بم ‎CO2‏ نیاز دارد یا ن اشد. عملکرد سلول متناسب با فضاو أى طح موجود است. تطلمين رشد يى تك لايد سلولى يكنواخت .دن يسيارئ ارد از اهمیت زیادی برخوردار است به خصوص در ظروف کشت چند خانه ای ‎i)‏ 4 یا 06) خانه ای. ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ ‎ 

صفحه 23:
شستشو و استریلیزه کردن وسایل سترسی به طیف وسیعی از ظروف پلاستیکی کشت سلول لزوم شستشو را به طور قابل توجهی کاهش داده است. به هر حال ظروف شيشه اى مثل ببيتها بايد در محلول شستشو دهنده خیسانده شوند و سپس فرآيند شستشو با خيساندن در آب مقطر به خوبى صورت كيرد. سيس فرآيند خشك كردن و استريليزاسيون آن ها انجام شده به اين شكل كه مقدارى بنبه در ورودى بييت ها قرار داده و با کاغذ اتوکلاو آن ها را کاملا محصور نموده و با دمای 060 درجه سانتیگراد به مدت 00 دقیقه اتوکلاو نمایید. همچنین ظروف شیشه ای مثل پیپت هاء فلاسک ها مخروطی و ارلن و بشر ها ( با یک پوشش آلومینیومی ) در آون با دمای 1060) درجه سانتیگراد به مدت 4 ساعت استریل می شوند. شاخص های استریلیزاسیون مانند چسب های استریلیتی ( چ اتوکلاو ) برای هر دسته از وسایلی که استریل می شوند به منظور اطمینان از عملکرد موثر دستگاه های فوق ضروری می باشند. برای وسایلی که به صورت باز و بدون بسته بندی هستند از کیسه های اتوکلاو استفاده نمایید. فویل های آلومینیومی نیز مورد خوبی برای بسته بندی نمودن اين وسایل جهت اتوکلاو هستند. 

صفحه 24:
Stationary cultivation 

صفحه 25:


صفحه 26:
Culture dish Stackculture chamber 

صفحه 27:
فریزرنیتروژن مایع/ (۷۰-) همواره چه برای لاين های سلولی که مکرراً تکثیر می شوند و چه لاين هایی که در نهایت از بین می روند» نمونه های از کشت جهت ذخیره سازی باید فریز شوند. این عمل به منظور ممانعت از جهش سلولی و محافظت از لاين سلولی در مقابل آلودگی و دیگر اتفاقات ناگوار صورت می پذیرد. فرآيند فريز كردن سلول ها عموماً برای تمامی انواع سلولی صورت می گیرد. سلول ها باید در فاز تصاعدی رشد با یک نگهدارنده مناسب که معمولا دای متیل سولفوکسید ( 050 ) است فریز شوند. سلول ها معمولا ابتدا چند ساعت در 000 درجه قرار داده می شوند و سپس در نیتروژن مایع (198)- درجه فرو برده می شوند ( در ویال های کوچک درب بسته ) یا اينکه در فاز گازی که در قسمت بالای مایع قرار دارد تگهداری می شوند. مواردی از تخریب و مرگ سلولی در ‎PD‏ درجه مشاهده شده است» بنابراین اولیت استفاده از نیتروژن مایع است. ویال ها را مى توان در یک جعبه پلی استایرنی با دیواره های |) اینچی فریز نمود. 

صفحه 28:
Cell storage (Cryopreservation) A process where cells are preserved by cooling to low sub-zero temperature, such as (typically) 77 K or -196 °C (the boiling point of liquid nitrogen) At these low temperatures, any biological activity, including the biochemical reactions that would lead to cell death, is effectively stopped. However, when vitrification solutions (e.g. glycerol) are not used, the cells being preserved are of ten damaged due to freezing during the approach to low temperatures 

صفحه 29:
Cell revival + Bring cyropreserved cells out of hibernation. + Adquick increase of temperature up to culture condition. + Need to remove vitrification solutions and damaged cells. 

صفحه 30:
An example of cryopreservation and revival Thawing Cel *Bring vials directly from liquid nitrogen tank *Cells are thawed by swirling the vials in 40¢C water until the pellet metts to the size of a small pea. At this point, the rest of the pellet will thaw quickly *Place the vials in centrifuge tubes and centrifuge cells for 10minutes, 50 +Ro-suspend the cells and plate into flasks as you would fresh calls FREEZE SLOWLY AND THAW QUICKLY. Freezing Cell *Colls are detached, centrifuged, re- suspended *Add DMSO to the cell suspension at a 9% concentration and mix with pipet “Aliquot the resuspension to bioireeze vial *Placo vials in styrofoam freezer box and place box (OPENED) in 4°C refrigerator for 15 minutes *Close the box and transfer it to the -20°C freezer “QUICKLY seal box with tape and transfer it to the -80°C freezer Finally transfer it to liquid nitrogen tank 

صفحه 31:
امکانات شمارش سلولی امکان ردیابی رشد سلول ها به صورت چشمی وجود ندارد» اما دقت هرچه ۰ بیشتر در شمارش سلولی برای اغلب اهداف آزمایشگاهی مورد نیاز است. معمولترین وسیله مورد استفاده جهت انجام شمارش سلولی» لام نئوبار هموسایتومتر است که اساسا برای شمارش سلول های خونی طراحی شده است. اين لام ضخیم از یک سری خطوط عمودی و افقی به صورت مشبک تشکیل شده که میانگین تعداد سلول ها در 6۳ خانه که خود از 0) خانه کوچکتر تشکیل يافته آند شمارش می گردد. سوسپانسیون سلولی پس از پیپتینگ مناسب جهت جدا شدن کامل سلول های چسبیده به هم در زیر لامل بر روی اين لام لود می شود. پیپتینگ مناسب سوسپانسیون سلولی قبل از لود كردن بسيار اهميت داردء اين کار به منظور دقت بیشتر و شکستن توده های سلولی به هم چسبیده که کار شمارش را با سختی مواجه می کند صورت می گیرد. تعداد سلو های شمارش شده در این خانه ها در ‎CDEP‏ ‏.نشان دهنده میزان سلول ها در هر میلیمتر مکعب از سوسپانسیون است 

صفحه 32:
Hemacytometer © 06 6 6 66©© 6 6 6 

صفحه 33:
Hemacvtometer 4 i 02, 025 Lien iene 

صفحه 34:
Goal for today : Prepare a 5-ml sterile culture containing 2.4x 10* cells/ml Counting: chambers Cover gla _~ mounting support 0.1mm sample depth 

صفحه 35:
Using a ۲ Cell Suspension 433 ]هن 0.1 mm deep 

صفحه 36:
Counting Cells Small equa = 1/400 0q mm. /25eq. mas comming 2a (ettral ar Count only LIVE cells, the NOT blue ones, in the four big corner grids & determine average number live cells in one big corner square (16 small squares). 

صفحه 37:
(4 << ۱ 7 [1۳۹ ee me = 200000 1 ‏ابا بل لاه‎ 2 ( ‏:ناته معن‎ 1 + Suspends and removes ۳ 3 Dissecting microscope: 3200 ۱ 7 ‘target tissues in case of primary Prevents room air from entering the hood. Aine ۱ i 

صفحه 38:
the growth status <= } Inverted microscope] PSU eekly متقامعء أقطا ممعسممعطام عط ‎as}‏ ‎me acer oy‏ ل ل ‎visible light when irradiated with the | Tees ‎ ‎ 

صفحه 39:


صفحه 40:


صفحه 41:
سايى تجهيرزات مورد نياز علاوه بر وسایل و امکانات فوق تعداد دیگری از تجهیزات نیز برای انجام » عمل کشت سلول مفید هستند. یک حمام آب گرم یا بن ماری و سانتریفیوژ برای انجام کار ضروری به نظر می رسد. یک پمپ مکشی جهت تسریع در مکش محیط کشت و مواد و جلو ی از آلودگی مفید خواهد بود. پمپ باید به طور مناسبى مائع از بازكشت مايع به محيط كردد. تجهيزات اضافى شامل بييت هاى مدرج در سايز هاى مختلفء لوله ها و فلکون های سانتریفیوژ» نگهدارنده هاى عمومى» پیپت های یک بار مصرف و بالن های پلاستیکی جهت استفاده با پپپت ها هستند. میکرو های دقیق یا سمپلر ( حجم های ‏ تا 1)00000) میکرولیتر ) برای تیمار ها با مواد شيميابي مورد استفاده هستند. ابن ميكرويييت ها يه صورد یک بار ابل اتوکلاو و پلاستیکی موجود هستند. برای انجام آزمایشات اختصاصی تبز مفکن است به تجهیز ات خاض دیگری نیاز باشد 

صفحه 42:


صفحه 43:
۳ BmL ~ 2b Liquid handling BOmL ~ ImL 

صفحه 44:


صفحه 45:
Types of contamination in cell culture * Biological ~ Bacteria ~ Fungi ~ Cross contamination by other cell cultures * Chemical ~ Residues left from detergents or disinfectants on glassware, pipettes, instruments, ete. ~ Metal ions, other impurities in water - ‏امامت‎ Pic bi bioreactive part of the cell wall of bacteria (endotoxin molecules are ched flem bacteria and are left behind even after bacteria die) 

صفحه 46:
‘Two types of contamination usually overlooked + Mycoplasma ~ Smatlest free-living prokaryotes ~ Not killed easily by many antibiotics - Contamination car't be seen by scopic evaluation ~ Mycoplasma testing should be done (several tests are available) ~ Long-term effects of mycoplasma contamination include reduced growth rate, changes in cell shape and metabolism, and chromosome abnormalities + Endotoxin ~ LAL test: an extract from the blood of horseshoe crabs is used to test for endotoxin (horseshoe crab blood contains a protein that binds endotoxin & can be detected) 

صفحه 47:
Signs of contamination ~ Sudden change in pH is often a strong indicator of contamination * Turbidity - Media looks cloudy * Microscopic evaluation - Microorganisms morphologically different from cells in the culture 

صفحه 48:
Cross contamination 9 ‏سم‎ infects the worker or contaminate or the environment + Important for prevent cross contamination ~ You want to be sure you are growing only the cells you want to grow - a single unwanted cell can ruin an experiment or a multit $ ion $ production run + Important for the lab worker ~ Some cultures can pose health threats to workers if they are inhaled, ingested ‘or absorbed - good ‘techniques prevent exposure of Secs 

صفحه 49:
ا * Contamination is a fact of life when dealing with cell cultures * Very difficult to prevent entirely, but good lab practices can keep contamination incidents toa minimum ® Proper cleaning and sterilization of glassware. pipettes. and other lab instruments (autoclave) € Practicing sterile technique when working with cell cultures 

صفحه 50:
5 2 + Media ic usually sterilized by auteclave or filtration ~ Standard filters ore 0.22um - 045, smaller than most microbes. But they do net remave all microbes ‏وع)‎ mycoplasm, viruses) ~ Unlike bacterial media, cnimal cell medic cannot be autoclaved, becauce this would dectroy mary of the growth factors and other molecules needed for cell growth * Working with cals in loninar fl hood iohazard levels ~ Different bie + Disinfect and antibotics - 70% Ethane! ~ Ampicilin, ere * Minimizing contomination through awareness ~ Inoculation loop, pipettes, pipette tips, ete. chould never touch contaminating surfeces ~ Containers holding medic and other cell additives should be kept closed until needed, then opened briefly 

صفحه 51:
‘Autoclave ~ Applies hect under high pressure; this increases the boiling point of water to 121 ~ 16-20 min. ic sufficient to kill most microbes Filtration ~ Lerge volumes: suction filter ~ Small volumes: zyringe filter UV radiation ~ Causes mutations to farm in ‘the DNA of microbes, causing genetic damage and eventual death = Used to sterilize surfaces (cuch os the curface of laminar flow hoods) 

صفحه 52:
Growth Cycle Growth curve. Increase in cell number on a log scale plotted against days from subculture. a) Defines the lag, log (exponential), and plateau phases, and when culture should be fed and subcultured after the indicated seeding time. b) b) Shows the kinetic parameters that can be derived from the growth curve: lag from the intercept between a line drawn through the points on the exponential phase and the horizontal from the seeding concentration; doubling time from the time taken, in the middle of the exponential phase,for the cell population to double; saturation density from the maximum (stable) cell density achieved by the culture, under the prevailing culture conditions. This is determined in cells/cm2 (cell density rather than cell concentration) and is not absolute, as it will vary with culture conditions. It is best determined (as characteristic of the cell type) in conditions that are nonlimiting for medium, e.g., a small area of high- density cells in a large reservoir of medium (such as a coverslip, or a filter well insert, in a non-tissue culture-grade dish) or under continuous perfusion of medium. [Adapted from Freshney, 2005] 

صفحه 53:
Growehphase of Cells tn eaftwre *pagphase radapt tonew environment ‘repair cel( membrane damage *Log phase rexponential growth: cellsare dividing *PlateanorStationaryphase reel growth % :Contact inhibition ofmovement :Density limitation ofgrowth 

صفحه 54:
pusaIes 70 02 4 6 ‏8ه‎ ‎Days from subculture 10 a 10 (b) Cate mr! Cells / mi 

صفحه 55:
- Tissue culture laboratory: Staining bench paroqdn, i : 

صفحه 56:
Types of tissue cultures + Primary tissue culture, + cell tines. J+ Primary tissue culture: Refers to cultures prepared from tissues taken directly from animals. + Gals are explanted directly from a donor organism, e.g. white blood cells or nasal bushings. They may be Capable of one or two divisions in culture, and given the right conditions can survive for some ime, They do not Continue to grow and eventually senesce and dle. + Ieincludes : 1- Organ culture: Means the maintenance of a piece of tissue, a part of organ or a whole organ in vitro. 2- Primary cell culture: Obtained when taken tissue is dissociated, mechanically or enzymatically, into single cells which could be plated on a coated surface. 3- Slice tissue culture : Cultures developed primarily by Harrison would now be referred to as explant or organotypic cultures.In which, small pieces of tissue of interest are simply allowed to attach to an appropriate substrate and are cultured in enriched media 4- Reaggregate culture: Dissociated cells is kept in suspension rather than allowed to settle on and attach to solid substrate. + In which, cells tend to reaggregate into small balls. + This type of culture permit cells to develop in three dimensions. totypic or histoculture: High density slice culture of one cell type 

صفحه 57:


صفحه 58:
Cell line: Primary cell cultures can be passaged a finite number of passages before reaching a crisis. ¢ Passages before crisis are referred to as a cell strains. * Cells that survive the crisis and continue to grow are referred to as a cell line. 

صفحه 59:


صفحه 60:
Types: 1- Continuous cell line: Population of cells that can be passaged indefinitely and express reasonable stable phenotype. 2- Transformed cell line: Cell lines obtained from tumor cells. 3- Clonal cell line: Cells could be cloned in continuous cell lines to obtain genetically homogenous population. 

صفحه 61:
Cultivation of Antmal coll $ * Frog neuroblast culture =>grownin clottedlymph *:Chickembryofibroblast =>growninplasma *:Development of medium for growing cells 

صفحه 62:
Media for cell cultivation :Plasma Interstitial fluid * 7 5 ‏با با‎ YS extract assubstrate,catalysts or cofactor 

صفحه 63:
Commercial cell culturemedia :Minimum Essential Media (MEM) :Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM) :Opti-MEM. ‘RPMI- (for suspension cel) ?*RPMI- (for mammalian cell) 

صفحه 64:
CH Cultivatio * Skin,epitheliumcell, eye kidney, liver,ovary * glands, bone, nerve * connective tissue, Skeletal muscle * toothprimmordia, bonemarrow, lymphocyte * Fromyounganimals *Cell cloningSeparation, Hybrids,Largescaleprodu 

صفحه 65:
Tissue culture * Organculture Maintain original structureandability to differentiatio * Primary explant culture :mmin size * CelC culture sfromsingle cell sLackcelC-celCinteractionand differentiation 

صفحه 66:
Growth medium Glucose Water Amino acids Salts 

صفحه 67:
Opportunity for Gas Exchange * Oxygen * Carbon dioxide 

صفحه 68:
Animal serum * Foetal Bovine Serum * Essential for animal cell proliferation * 5% - 10% of growth media 

صفحه 69:
Indicator * Waste products causes change in pH * Use indicator like phenol red * Changes from red to yellow 

صفحه 70:
Control of Temperature and pH ۰ 37.5 6 ۰ 0 5 

صفحه 71:
Method for Measuring Cell Growth * Counting cell numbers in culture (haemocytometer) + Measure optical density in spectrophotometer 

صفحه 72:
Cells are either.... * Anchorage - dependant * Anchorage - independant 

صفحه 73:
Anchorage - independant cells * Cells associated with body fluid -blood cells * Grown in suspension * Will eventually need subculturing 

صفحه 74:
Anchorage - dependant cells Most animal derived cells Adhere to bottom of a flask and form a monolayer Eventually cover entire surface of substratum (confluence) Proliferation then stops Need to subculture cells at this point (remove to fresh medium) Proliferation can begin again 

صفحه 75:
2 main categories of animal cell cultures.... ۰ Primary culture * Continuous cell line 

صفحه 76:
Primary Cultures Taken from fresh tissue Limited life span in culture Treated by proteolytic enzyme (Trypsin) Separate into single cells -epithelial cells -fibroblasts 

صفحه 77:
Continuous Cell Line Derived from humans Been transformed -lose sensitivity to factors associated with growth control Produce immortalised cell lines Cell lines are neoplastic Often lose their anchorage-dependence -associated with an altered xsome pattern More easily cultured 

صفحه 78:
Suspension Culture * Mostly fiemopoieticcells anda few others * Specializedculturemediummay be required * CelCswithhighmetabolicactivities can be obtain *Celsthat are not abletogrowinsuspension :Thosecan beattachedontothe surface ofcarrier particles andgrow 

صفحه 79:
Primary cell cultureand Establishment cell Cine °* Preparation ofeell suspension fromintact tissue 1.SinglecelC preparation rusemechanical,Chemical.and/or enzymaticmethod 2. Disaggregate or dissociatecell reutting, homogenizing, rotary shaker, vortex, pipette, teasing 

صفحه 80:
° Preparation of cell suspensionfromintact tissue (e ny ‏پيصتثپيست يت‎ مسپيپ_ىپسىیی!!‎ “Enzymes ** * Trypsin (crude) sfromcattleandpig’spancrease tcontain Chymotrypsin, elastase, ribonuclease, deoxyribonucleaseandamylase 

صفحه 81:
"Enzymes ** * Collagenase sfor connectivetissue * Pronase sfor fibroblast ۰ Efastase tfor fibroblast protein * Deoxyribonuclease tfor DNA 

صفحه 82:
*Chelaringagent ** * Ethylene diamine tetraaceticacid (EDTA) or Versene sbindpermanentlytoCat* and Mg** that maintain thecel(ular matrix iprevent cell aggregation sIt’s better tousein combination withTrypsin * Sodiumcitrate 

صفحه 83:
° Preparation of cell suspensionfromintact tissue (e ny ‏پيصتثپيست يت‎ مسپيپ_ىپسىیی!!‎ * Source of tissue *Young animals e.g. Ridmey (Monkey, Dog, Rabbit), Chickembryo :0(danimal tissue contains alargeamow nt of connectivetissue 

صفحه 84:
° Preparation of cell suspensionfromintact tissue (e ny TTT 1. Removal of tissueandplaceinIsotonic (or growthmediumwithantibiotic) a 2. Trimoffunwantedpartsandcut intosmaller pieces = 8. Dissociate celCsusing enzyme th 4. Remove large debrisandwashcells 

صفحه 85:
° Preparation of cell suspensionfromintact tissue (e ‏ااانا اا ايان‎ = 5.Suspendcellsin growthmediumaccordingly a 6. Pipetteintoculturevesselandincubate 

صفحه 86:
Primary cell culture cloning Physical separation Sublineor celC strain 

صفحه 87:
جاگ ههد * The American Type Culture Collection (ATCC) * The Ewropean Collection of Animal Cell Culture (ECACC) * NationalInstitute ‏كذ‎ 3. * National Cancer Institute (NCI),USA 

صفحه 88:
° BHK- sfrombay hamster kidney FMD and Rabies vaccine for animaluse * 0340-6 ifromChinese hamster ovary vusein recombinant DNA technology 

صفحه 89:
Comoman Coll Cine cont.) * HeLa: from Henrietta Lach! cancer tissue sharbors HPV type 78 genome °Vero: sfromAfrican green monkey kidney ipreparation of Poliovirus vaccine 

صفحه 90:
* Establishment ofSuspension calewre :Heteroploidcell Cine {suspension culture 1. Resuspendtrypsinized cells tos x 10’ cells/ml 2.Continous stirring i 3.Cellular product beremoved andreplenishedwithfreshmedium