کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

صفحه 1:
تاریخچه کروماتوگرافی © توسعه كرومات وكرافى مایع با فشار بالا در اواسط دهه ۱۹۷۰ انجام شد و پیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تكامل مواد پک شده درون ستون كرومان وكرافى و همجنين دتكتورهاى اتوماتيكى كه مى توانستند بصورت آنلاین مقدار عبور مايع را محاسيه تمايت. كاري دهاى كروماتو كراق ص در آواخر دهه ۰۱۹۷۰ روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با نز اين امكان را قراهم کرد تا جداسازی ترکیات بر شاب ی گرد در ده ‎bE ee Aes.‏ ای ری تا ار فى قده تکنیکهای جدید روشهای رن شناسایی . خالص سازی و محاسبه مقدار را متفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار ۰ کامپیوتر و اتومامیون به سایر روشها اضافه گردید به مرور تکامل انواع ستونها . تولید ستونهای بسیار باریک ‏ ستونهای پیوسته باعث سرعت در کار 1۳1,60 گردید. ‎a lig ee es BS‏ ترا 11810 بوده ايم. قطر معمول میکروستونها یا ستونهای موبی شکل ۰ حدود 3 1110 تا 200 1010 دارد. طول ستونهای ‎“Ep PLC‏ کمتر از ستونهای :11۳1.6 معمولی و برابر 3 10180 است و در بخشهای بسیار کوچک در دستگاه ‎FPLC‏ جاسازی می گردند هر چند که امروزه ۳1۳1.62 مورد توجه ت داروسازی است اما اين موارد ققط ‏ ۵۰ درصد استا ‎٠‏ .كمياوى و بيركيمياوى و همجنين صنایع ‏ان ناآ 11 را نشان ميدهد 

صفحه 2:
کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد ۲۱۳۱ دائیم که کروماتوگرافی روشی است براي شناسائی و جدا سازی و اندازه اد. ‎HPLC‏ ‎EEE ae atlas OL; df ated‏ رد اد ل شده است. که فاز ثابت ممكن است جامد و يا مايع باشد و فاز متحرك ماي تمام روش‌های جداسازی تجزیه‌ای با فروش سا یل اب یرآمیز عبارتند از حساسیت روش ؛ سا زگاری سریع ‎dace‏ ام برای جداسازی مواد گونه‌های غیرفرار یا پل گرما و مهم تر از همه . کاربرد گنت براي موادی است که در 5 ناپایدار در مختلف علوم و جامعه اهمیت ‎Doi die‏ مزیت کروماتو گرافی بت به ستو تقطیر این که به آسانی می‌توان به آن دست یافت. با وجود اينکه ممکن است چندین روز طول پکشد تا ب ده خوج پرسد. ولی یک جداسازی کرومات وگرافی مى تواند در عرض جند دا آز مزايأى برجستة روشهاى كروماتو كرافى اين است كه أنها آرام هستند. به اين معنى که احتمال تجرية مواد جنا به وسيله اين روشها در مقايسهريا ساير روش ها كمشر است.مزیت دیگر روش‌های کروماتوگرافی این است که تنها مقدار بسيار كمى از مخلوط براى ‎ae‏ ‏لازم است. به اين علت» روشهای تجزیه‌ای مربوط به جداسازی کروماتو گرافی می‌توانند در مقیاس مب و نیمه میکرو انجام گیرند 

صفحه 3:
انتخاب بهترین روش کروماتوگرافی عموماً تجربی است. زیرا هنوز هیچ راهی برای پیش‌پینی بهتریین روش برای جداسازی اجسام؛ مگر در چند مورد ساده وجود ندارد. در ابتدا روش‌های ساده‌تری مانند کرومات و گرلفی کاغذی و لایه نازک امتحان می‌شوند. در صورتی که با لین روشها مستقیماً قادربه جداسازی باشند. جداسازی را بلید.به وسیلة آنها صورت داد. در غیر این صورت. از روش‌های پیچیده‌تر استفاده می‌شود. کروماتوگرلفی ملیع با کارلیی بالا (13۳1,67), وقتی که روش‌های ساده فلقد کارلیی لازم هستند, ‎Gly ath Sie use‏ دانشمندان دریافتند که بهترین نوع به خاطر دقیق تر بودن کروماتوگرافی ژلی است. انتخاب نوع روش کرومات وگرافی بجز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافی گازی در جداسازی گازها) 

صفحه 4:
فاز ساکن و فاز متحرک کار در مورد فازهای ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد و آن » این است که باید قطبیت حل شونده و فاز متحرک ‏ نزدیک به هم باشد. ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترت گروه‌های عاملی در تر کیبات به صورت زیر است: هیدرو کربن < اترها < استرها < ‎bogs‏ > آلدئیدها < آمیدها < آمین‌ها < الکل‌ها به عنوان مثال ۰ فاز ساکن با قطبیت بالا مثل سیلیکات یا آلومین یا مایعات قطبی مثل تری‌اتیلن که روی ذراتهسیلیکات قرار كرفتالئد و فاز متحرك + حلال نسيتا غير قطبى مكل هكرا پروپیل اتر را می‌توان نام برد. 

صفحه 5:
طریقه عمل ستون ‎HPLC‏ کار این ستون نیز به اندازه ذرات داحل ستون بستگی دارد. هرچه اندازه ذرات کوچک‌تر باشد کیفیت 111.6 پیشتر می‌شود. 

صفحه 6:
خلوص بالا نقطه جوش حدود ۲۰ تا ۵۰ بالاتر از دمای ستون * گرانروی پایین واکش پذیری کم © قابلیت تطابق با آشکارساز ® سمیت و اشتعال پذیری کم 

صفحه 7:
آشکارسازها کار آشکارسازهای مورد استفاده در کروماتو گرافی مایع - ماع تمام خصوصیات. آشکارسازهای کروماترگرفی گازی را دارنده بجز اينکه در آشکارساز کرومات و گرافی مایع نیازی به محدوده دمایی این شناساگرها کلاً دو دسته‌اند: کت کلب رک مک تا © نوع خاصی که به حل شونده حساس هستند. 

صفحه 8:


صفحه 9:
اجزاء دستگاه: © مخازن حلال #موتور یا پمپ اینچکتور #ستون #ردیابها #ثبات ( دتکتور ) oo 

صفحه 10:
مخازن حلال که در آنها فاز متحرک و يا حلالهای شستشو دهنده ستون ريخته شده است. 

صفحه 11:
موتور یا پمپ چون ستونها نسبتا طویل و اندازه ذرات کم است. به این جهت قابلیت نقوذ کم می شود و برای این كه حلال جریان داشته باشد باید فشاروجود داشته باشد. برای ایجاد فشار از پمپ یا موتور استفاده می کنیم. پمپ فشاری حدود 4500 251 می تواند ایجاد کند. و باید بتواند فشار ثابت ایجاد کند حلال توسط پمپ با فلوی ثابتی بر روی فاز ثابت حرکت داده می شود. حداکثر فلوئی که فاز متحرک می تواند داشته باشد 5 101/1011 است. و بسته به نوغ کاری که می خواهیم انجام دهیم فلو فرق مى كندء هر جه فلو كمتر باشدء فاصله پیک ها بیشتر است. چهارمخزن داریم مخزن ۸ ,13 ,0) ,لآ میزان فشار بستگی به فلوى ما دارد وقتى فلو 0.8 101/۳00 است فشار حدود 1500 5 می شود. میزان فشار بستگی به نوع ستون دارد حداکثر فشار مجاز 0 است. حداكثر تغييرات فشار 100 251 است. عبا كر فلوریت ۰ ۳۵:6 ۳10۲۷ 5 ۲01/1010 است. پس ‎ey‏ حلال را از مخزن مى كيرد و با سرعت كذر ثابتى آن را بداخل دستگاه وارد می کند. در دمای آزمایشگاه به دو روش می توانیم کار کنیم: 

صفحه 12:
الف- روش ایزوکراتیک 506۲116]: اگر نسبت های مختلفی از فاز متحرک را در یک مخزن پزیم و از همان مخزن فاز متح رک را پرداشت کنیم از روش ایزو کراتیک استفاده کرده | در کار عملی انجام شده درآزمایشگاه فاز متحرک( 1۸۰ بافر فسقات 1۱۲ متانول و 1۸ ) است که پس از صاف کردن همه را در يك مخزن مثل 8 مى ريزيم و از همان مخزن پمپ برداشت هق ‎al‏ 

صفحه 13:
ب - روش گرادیانت ]0۲۵0161 : اجزاء فاز متحرک در مخازن مختلف ریخته می شود. دستگاه قابلیت این را دارد که خودش نسبت های مختلف را از مخازن برداشت کند (طبق داده های ما مثلا می خواهیم ازمخزن ۸۰8056 از مخزن 3 6 و از مخزن 126 6 بكشد. و بعد نسبت ها را مخلوط می کند. از اين روش وقتی استفاده می کنیم که نسبت های موردنظر را نمی دانیم و بخواهيم روش کار پیدا کنیم. ولی وقتی درصد فاز متحرک برای ما روشن شد مى توانیم از روش ایزو کراتیک استفاده کنیم. فاز متحرک با فلوی ثابتی بر روی ستون حرکت داده می شود حدا کثر فلو در این آزمایش 101/10110.8 یا ۱ است. بعد از فعال كردن هر ‎flow rate‏ )!5 كم به زياد كم كم بالا مى بريم تا حدود 0.8 ‎eS oo) ml/min‏ حدود یک ریع ساعت يا نیم ساعت با فلوریت بالا کار کند و بعد فلوریت را به تدریج پایین می آوري تا صفر و یعد پمپ را عوض می کنیم. يا دستگاه را خاموش می کنیم» فلوریت که با برود فکار با می رود. بعد از اتمام کار ستون را با حلالهای شستشو دهنده مي شوئیم. حلالهای شمتشو را در مخازن دی و بسب ها راابة ترتيب فعال مى كيم اول دستكاه را با اب و ول شمه وس با سول خالص مى شوثيم. هر يمب را كه فعال كردي ابتدا هوا كيرى كنيم. تهیه بافرفسفات: ۱۳۶ گرم از 041121 را وزن كرده ( 0.104) و به حجم یک لیتر می رسانیم » 11 5 می شود که با اسید فسفریک غلیظ حدود یک دو قطره 011 را به حدود ۳.۵ می رسانیم. 

صفحه 14:


صفحه 15:
1۳6010۲ -3 از سرنگهای مختلف با ظرفیت های مختلف استفاده می كنيم. حجم تزريق ۳ میکرولیتر است. نمونه ادا وارد قسمتی بنام گارد کالوم يا برى كالوم مى شود که محافظ ستون است. طول کارد کالوم حدودم یک سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است. و ماده ‎gue JOT og‏ ماده پر کنیده ستون است اگر ماده ما ناخالصی داشته باشد يا با ماده داخل ستون واکنش ایجاد کند Z ‏در گارد کالوم انجام می شود و به ستون آسیبی نمی رسد.‎ 

صفحه 16:
a 4- ستون؛ طول ستونهای دستگاه حدود ۱۰-۳۰ سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترین ستون 015 ‎١01‏ كا وسيل میلان است؛ ستونها را پس از م کار باید با محلولهای شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده کردیم ستون را با ‎OT‏ و متانول و بعد با متانول خالص شستشو می دهیم. فاز ثابت بصورت ذرات ریزی در داخل ستون قرار گرفته است. که بر اثر چسبیدن پر پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرک جداسازی انجام می شود. نمونه انا وین ره کالم و بمد وا ريتوت فى شود ‎eo ee 0000 Le‏ غیرقطبی زیادی دارده فاز متحر استفاده از متحرک و ماده پرکننده ستون از نظر قطبیت باید عکس هم باشند. در 2 ترمال و معکوس هست. آگر فاز ثابت قطبی و فاز متحرک غیرقطبی باشد سیستم را فاز تیم و در ‎daze‏ که ستوا غیرقطبی و حلالقطبی باشد. سستم را نز ممگوس می سيلان وقيل سيلان إيجاد ستونهاى غير لج بي کنند و معمولا قطبى است بنايراين از فاز معكوس استفاده مى شود. جنس تاد ات ‎Dee‏ غیر قطبی و فا متحرک ستونها از فولاد ‎eo‏ ی ‎‘inless el‏ 

صفحه 17:
تصاویر ی از چند ستون اوو- = ——= cD ) ‏لار چه‎ nhs —— | 

صفحه 18:
5-ردیابها: رديابها بايد حساس باشند و اثر مخرب بر روی اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسیعی برای غلظت بايد خطى باشد. نواع رد یاب ها: ‎a ©‏ -مهمترین‌آنها ردیابعاورا بسشت سکب بسولیلجسامی‌که در ناحیه ‎UV-VIS‏ جذب لشته ب‌اشند مورد لستفاده قرار میگ .در لیرستکتور چابنجام مي‌شود و با شکاسته ‎ ‏۳ نقابلاندانه گیریلس عیزلن کاسته شدنلنرییمتاسب ‏لستبا غاظتساید طولموج را مشخ ص‌کنيم که در لینجا1-225 11110 لست‌حادلناید در طول ‏عوج لمنتخلبجذ بهلشته باشد ‏© . طردياب ضريب شكست: اين ردياب خيلى حساس به حرارت است.از تغييرات يا تفاوتى كه بين ‏ضريب شكست سيستم حلال به تنهایی و سیستم حلال همراه نمونه ایجاد می شود استفاده می کنیم. تکتور ف-ویسانس‌جساس‌تسر از ۷[ لستولی کم مصرفعیب اشد چونموادی‌که خاصیت ‎eth ls‏ بساشند کم هستند ‏© . لبردیاب الکتروشیمیایی که عملکرد آن بر مبنای. وا کنش های اکسید و احیا می باشد. ‎ ‎ ‎ 

صفحه 19:


صفحه 20:
eq #در اثر حرکات قلم پیک هایی ‎ae‏ رکوردر): : به طریق کیفی پیک ها را براساس زمان باز داری یا نگهداری یا ‎Retention‏ ‏6 می شناسند. زمان بازداری فاصله زمانی از لحظه تزریق تا رسیدن به نقطه اوج یک پیک است. برای محاسبه کمی سطح هر نوار جذبی را حساب می کنیم» سطح هر نوار جذبی متناسب با مقدار جسم است که بوسیله انتگراتور یا سطح سنج با دستگاه ثبات پدست می آید سطح هر نار جذیی یعنی حاصلضرب قاعده * لصف ارتفاع است. روش بریدن نوار و وزن کردن آنها روش قديمي است. ولی امروزه توسط سطح سنج یا انتگراتور بدست می آید خود دستگاه ۸۵1/2 را مشخص می کند. . مي توان آز ارتفاع هم ال ‎So‏ و ارتفاع با یک دستور ساده قابل ديل به ماد روش رسم منحنی را انجام می دهیم. در محور آفقی غلظت ها و در محور ‎as‏ ۸ . بعد از رسم منحنی استاندارد. غلظت مجهول را از روى رسم منحنى بدست می آوریم. 

صفحه 21:
۲ 2 انواع کرهماتو گرافی © كروماتوكرافى تقسیمی کروماتوگرافی تبادل یونی کروماتوگرافی جذب سطحی کروماتوگرافی طردی ee 

صفحه 22:
کروماتوگرافی تقسیمی کرومات و گرافی تقسیمی در بین چهار نوع روش کرومات و گرافی مایع بیشتر از همه به کار برده شده است. در گذشته اکیر کاربردها به ترکیبات: نایونی, قطبی با وزن مولکولی کم و یا متوسط معمولا کمتر از ۳۰۰۰ مربوط بوده است. ولی اخیرا روشهایی ابدا شده اند ( مشتق سازی و زوج یونی ) که جداسازیهای تقسیمی را به ترکیبات یونی نیز بسط داده اند. به علت اينكه جداسازى در 0).آءآ به ميزان تقسيم اجزاى مخلوط بين دو فاز مايع بستكى دارد اين نوع کروماتوگرافی را كروماتوكرافى تقسيمى می نامند. 

صفحه 23:
ee کروفا ‎ae‏ تيال يولى در کروماتوگرافی تبادل یون از رزین های تبادل کننده ی یون به عنوان فاز ساکن استفاده می شود. رزین ها, پلیمرهای سنتزی با اتصالات جانبی هستند که پیوندهای کوالانسی و گروههای عاملی یونی شونده می باشند. در رزین های تبادل کننده کاتیون گروههای آنیونی و در رزین های تبادل کننده آنیون گروههای کاتیونی وجود دارند. یون مخالف یعنی یون متصل به رزین تقریبا آزاد است و می تواند در فاز متحرک آبی حل شود و درون ستون جریان یابد 

صفحه 24:
کروماتوگرافی جذب سطحی در روش 19010 از سیلیکای اصلاح نشده استفاده می شود. مکانهای جذب روی سطح سلیکا , سیلانول می باشند. در کرومات وگرافی با سیلیکا تعداد نسبی هر نوع از گروههای سیلانول بستگی به نوع سلیکا و چگونگی تهیه و مراقبت از آنها دارد.معمولا برای کروماتوگرافی , سیلیکا توسط حرارت دادن در ۱۵۰ تا ۲۰۰ سانتیگراد فعال می شود و سپس توسط فاز متحرک و میزان کمی از آب یا حلال آلی قطبی دیگر به مقدار جزئی غیر فعال شده تا میزان و جذب آن در حد استاندارد گردد. با وجود سیلیکا و فاز متحرک غیر قطبی که با میزان کم حلال قطبی تعدیل شده , لایه ای از مواد قطبی روی سطح سیلیکا جذب می شود. 

صفحه 25:
کروماتوگرافی طردی روشی است که مولکولها برمبنای اندازه موثر و شکل آن در محلول از یکدیگر جدا می شوند. و اگر از حلالهای آلی استفاده کنیم این روش اغلب کرومات وگرافی ژل تراوا و اگر از حلالهای آبی استفاده آن را کروماتوگرافی ژل صافی می نامند. فاز های ساکن مورد استفاده در کروماتو گرافی طرد ذرات متتخلخل با اندازه منافذ کنترل شده می باشند. و نباید بین جزء نمونه و سطح فاز ساکن برهم کنش موجود باشد. حجم کل فاز متحرک درون ستون عبارت است از مجموع حجمی که خارج از ذرات فاز ساکن می باشد. 

صفحه 26:
مزایای این روش كرومات وكرافى مایع با عملکرد بالا سریعترین رشد را در تجزیه ای با فروش سالیانه در گستره میلیارد دلار داشته است . و دلیل اين محبوا - حسامیت روش ۲- سا زگاری آن برای انجام اندازه گیریهای کمی صحیح - مناسب بودن آن براى جداسازی گونه های نافرار یا ناپایدار گرمایی ن تمام قنون جداسازی - کاربرد گسترده آن برای مواد پراهمیت در صنعت - زمینه های مختلف علوم و جامعه er 

صفحه 27:
م HPLC: jl ‏موارد استفاده‎ جداسازی, خالص سازی و شناسائی پروتئین ها و ترکیبات آلی بویژه ترکیبات دوائی. همچنین در برخی از آزمایش های مربوط به تعیین غلظت دواها مورد استفاده قرار می گیرد . در تحقیقات پروتومیک (تحقیقاتی که برروی پروتئین ها انجام می شود): آنالیز و هضم پروتتین مقایسه ساختارهای پروتئین های مختلف تعين ساختار بليمرها 

صفحه 28:
ا تشكر 1١/1/1١ 

تاریخچه کروماتوگرافی توسعه کروماتوگرافی مایع با فشار باال در اواسط دهه 1970انجام شد و پیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تکامل مواد پک شده درون ستون کروماتوگرافی و همچنین دتکتورهای اتوماتیکی که می توانستند بصورت آنالین مقدار عبور مایع را محاسبه نمایند .کاربردهای کروماتوگرافی در اواخر دهه ، 1970روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس این امکان را فراهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه ،عملی گردد .در دهه ، 1980بطور رایجتری از HPLCبرای جداسازی ترکیبات کیمیاوی استفاده می شده است. تکنیکهای جدید روشهای جداسازی ،شناسایی ،خالص سازی و محاسبه مقدار را متفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار ، HPLCکامپیوتر و اتوماسیون به سایر روشها اضافه گردید. به مرور تکامل انواع ستونها ،تولید ستونهای بسیار باریک ،ستونهای پیوسته باعث سرعت در کار HPLCگردید. در دهه گذشته شاهد ظهور میکرو ستونها و ستونهای تخصصی شده برای HPLCبوده ایم .قطر معمول میکروستونها یا ستونهای مویی شکل ،حدود µm 3تا µm 200دارد. طول ستونهای HPLCسریع ،کمتر از ستونهای HPLCمعمولی و برابر mm 3است و در بخشهای بسیار کوچک در دستگاه HPLCجاسازی می گردند. هر چند که امروزه HPLCمورد توجه تحقیقات بیوتکنولوژیکی ،کیمیاوی و بیوکیمیاوی و همچنین صنایع داروسازی است اما این موارد فقط 50درصد استفاده کنندگان HPLCرا نشان میدهد 2 کروماتوگرافی مايع با فشار زياد HPLC می دانيم كه كروماتوگرافی روشی است برای شناسائی و جدا سازی و اندازه گيری مواد HPLC .يعنی كروماتوگرافی مايع با فشار زياد يا كروماتوگرافی مايع با كاركرد عالی است HPLC .از دو فاز ثابت و متحرک تشكيل شده است .كه فاز ثابت ممكن است جامد و يا مايع باشد و فاز متحرک مايع است. HPLCبدون شک ،سریع‌ترین رشد را در بین تمام روش‌های جداسازی تجزیه‌ای با فروش سالیانه در گستره بیلیون دالر داشته است .دالیل این رشد انفجارآمیز عبارتند از حساسیت روش ،سازگاری سریع آن برای انجام اندازه‌گیری‌های کمی صحیح ،شایستگی آن برای جداسازی مواد گونه‌های غیرفرار یا ناپایدار در مقابل گرما و مهم‌ تر از همه ،کاربرد گسترده آن برای موادی است که در صنعت ،زمینه‌های مختلف علوم و جامعه اهمیت درجه اول را دارند .مزیت کروماتوگرافی نسبت به ستون تقطیر این است که به آسانی می‌توان به آن دست یافت .با وجود اینکه ممکن است چندین روز طول بکشد تا یک ستون تقطیر به حداکثر بازده خود برسد ،ولی یک جداسازی کروماتوگرافی می‌تواند در عرض چند دقیقه یا چند ساعت انجام گیرد.یکی دیگر از مزایای برجستة روشهای کروماتوگرافی این است که آنها آرام هستند .به این معنی که احتمال تجزیة مواد جداشونده به وسیله این روش‌ها در مقایسه با سایر روش‌ها کمتر است.مزیت دیگر روش‌های کروماتوگرافی این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه الزم است .به این علت ،روشهای تجزیه‌ای مربوط به جداسازی کروماتوگرافی می‌توانند در مقیاس میکرو و نیمه میکرو انجام گیرند. 3 انتخاب بهترین روش کروماتوگرافی انتخاب نوع روش کروماتوگرافی بجز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافی گازی در جداسازی گازها) عموم ًا تجربfی اسfت .زیرا هنوز هیfچ راهfی برای پیش‌بینfی بهتریfن روش برای جداسfازی اجسfام ،مگر در چند مورد ساده وجود ندارد. در ابتدا روش‌های سfاده‌تری ماننfد کروماتوگرافfی کاغذی و الیfه نازک امتحان می‌شوند .در صfورتی که بfا ایfن روشهfا مسfتقیم ًا قادر بfه جداسfازی باشنfد ،جداسfازی را بایfد بfه وسfیلة آنهfا صfورت داد .در غیر این صورت ،از روش‌های پیچیده‌تر استفاده می‌شود. کروماتوگرافfی مایfع بfا کارایfی باال ( ،)HPLCوقتfی کfه روش‌های سfاده فاقfد کارایfی الزم هستند، می‌توانfد جوابگfو باشfد .ولfی دانشمندان دریافتنfد کfه بهتریfن نوع بfه خاطfر دقیfق تر بودن کروماتوگرافی ژلی است. 4 فاز ساکن و فاز متحرک کار در مورد فاز‌های سfاکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد و آن ،این است که باید قطبیت ح ‌ ل شfونده و فاز متحرک ،نزدیfک بfه هfم باشfد ،ولfی بfا فاز سfاکن اختالف داشتfه باشد .ترتیfب قطبیت گروه‌های عاملی در ترکیبات به صورت زیر است: هیدروکربن< اترها < استرها < کتون‌ها < آلدئیدها < آمیدها < آمین‌ها < الکل‌ها به عنوان مثال ،فاز سfاکن با قطبیت باال مثل سfیلیکات یfا آلومیfن یfا مایعات قطبfی مثfل تری‌اتیلن گلیگول کfه روی ذرات fسfیلیکات قرار گرفته‌انfد و فاز متحرک ،حالل نسfبتا غیfر قطبfی مثfل هگزان یا ایزو پروپیل اتر را می‌توان نام برد. 5 طریقه عمل ستون HPLC کار این ستون نیز به اندازه ذرات داخل ستون بستگی دارد .هرچه اندازه ذرات کوچک‌تر باشfد ،کیفیت HPLCپیشتر می‌شود. 6 خصوصیات فاز متحرک ( ) HPLC خلوص باال نقطه جوش حدود 20تا 50باالتر از دمای ستون گرانروی پایین واکنش پذیری کم قابلیت تطابق با آشکارساز سمیت و اشتعال پذیری کم 7 آشکارسازها کار آشfکارسازهای مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع -مایع تمام خصوصیات fآشfکارسازهای کروماتوگرافی گازی را دارند ،بجز اینکه در آشکارساز کروماتوگرافی مایع نیازی به محدوده دمایی ال دو دسته‌اند: باال نیست .این شناسfاگرها ک ً یک نوع کلی که به فاز متحرک عکس‌العمل نشان می‌دهند. نوع خاصی که به حل شونده حساس هستند. 8 تصویری از دستگاه HPLC 9 اجزاء دستگاه: مخازن حالل موتور یا پمپ اینجکتور ستون ردیابها ثبات ( دتکتور ) 10 مخازن حالل كه در آنها فاز متحرک و يا حاللهای شستشو دهنده ستون ريخته شده است. 11 موتور یا پمپ .چون سfتونها نسبتا طويل و اندازه ذرات كم است .به اين جهت قابليت نفوذ كم می شfود و برای اين كه حالل جريان داشته باشد بايد فشاروجود داشته باشfد .برای ايجاد فشار از پمپ يا موتور استفاده می كنيم .پمپ فشاری حدود psi 4500می تواند ايجاد كند .و بايد بتواند فشار ثابت ايجاد كند. حالل توسfط پمپ با فلوی ثابتی بر روی فاز ثابت حركت داده می شود .حداكثر فلوئی كه فاز متحرک می تواند داشfته باشد ml/min 2.5است .و بسته به نوع كاری كه می خواهيم انجام دهيم فلو فرق می كند ،هر چه فلو كمتر باشد ،فاصله پيک ها بيشتر است .چهارمخزن داريم مخزن D, C, B, Aميزان فشار بستگي به فلوی ما دارد وقتي فلو ml/min 0.8است ميزان فشار حدود psi 1500می شود .ميزان فشار بستگی به نوع ستون دارد حداكثر فشار مجاز Psi 3500است .حداكثر تغييرات فشار Psi 100است .حداكثر فلوريت Flow rate ، ml/min 2.5است .پس پمپ ،حالل را از مخزن مي گيرد و با سرعت گذر ثابتی آن را بداخل دستگاه وارد می كند .در دمای آزمايشگاه به دو روش مي توانيم كار كنيم: 12 الف -روش ايزوكراتيک :isocratic اگر نسبت های مختلفی از فاز متحرک را در يک مخزن بريزيم و از همان مخزن فاز متحرک را برداشت كنيم از روش ايزوكراتيک استفاده كرده ايم .مثال در کار عملی انجام شده درآزمایشگاه فاز متحرك( %80بافر فسفات %12متانول و %8اسfتونيتريل) است كه پس از صاف كردن همه را در يک مخزن مثل Dمی ريزيم و از همان مخزن پمپ برداشfت می كند. 13 ب -روش گراديانت : gradient اجزاء فاز متحرک در مخازن مختلف ريخته می شود .دستگاه قابليت اين را دارد كه خودش نسبت های مختلف را از مخازن برداشت كند (طبق داده های ما) ،مثال می خواهيم ازمخزن A ، 80%از مخزن B 8%و از مخزن C 12%بكشد .و بعد نسبت ها را مخلوط می كند .از اين روش وقتی استفاده می كنيم كه نسبت های موردنظر را نمی دانيم و بخواهيم روش کار پيدا كنيم .ولی وقتی درصد فاز متحرک برای ما روشن شد می توانيم از روش ايزوكراتيک استفاده كنيم .فاز متحرک با فلوی ثابتی بر روی ستون حركت داده می شود حداكثر فلو در این آزمایش ml/min0.8يا 1است .بعد از فعال كردن هر پمپ flow rateرا از كم به زياد كم كم باال می بريم تا حدود ml/min 0.8يا 1و می گذاريم حدود يک ربع ساعت يا نيم ساعت با فلوريت باال كار كند و بعد فلوريت را به تدريج پايين می آوريم تا صفر و بعد پمپ را عوض می كنيم .يا دستگاه را خاموش می كنيم ،فلوريت كه باال برود فشار هم باال مي رود .بعد از اتمام كار ستون را با حاللهای شستشو دهنده می شوئيم .حاللهاي شستشو را در مخازن ريخته و پمپ ها را به ترتيب فعال می كنيم اول دستگاه را با آب و متانول شسته و سپس با متانول خالص می شوئيم .هر پمپ را كه فعال كرديم بايد ابتدا هوا گیری کنیم. تهيه بافرفسفات 13.6 :گرم از Po4H2Kرا وزن كرده ( )0.1Mو به حجم يک ليتر می رسانيم pH ، 4.5می شود كه با اسيد فسفريک غليظ حدود يک دو قطره pHرا به حدود 3.5می رسانيم. 14 سیستم های پمپ کننده 15 :injector -3 از سرنگهای مختلف با ظرفيت های مختلف استفاده می كنيم .حجم تزريق 30 ميكروليتر است .نمونه ابتدا وارد قسمتی بنام گارد كالوم يا پری كالوم می شود كه محافظ ستون است ،طول كاردكالوم حدودم يک سانتی متر است .و جنس آن از فوالد ضد زنگ است ،و ماده پركننده آن از جنس ماده پركننده ستون است. اگر ماده ما ناخالصی داشته باشد يا با ماده داخل ستون واكنش ايجاد كند درگاردكالوم انجام می شود و به ستون آسيبی نمی رسد. 16  -4ستون: طول ستونهای دستگاه حدود 10-30سانتی متر است .و جنس آن از فوالد ضدزنگ است. پرمصرف ترين ستون C 18 ، ODSآکتا دسيل سيالن است ،ستونها را پس از اتمام كار بايد با محلولهای شستشو دهنده شست .اگر از بافرفسفات استفاده كرديم ستون را با آب و متانول و بعد با متانول خالص شستشو می دهيم .فاز ثابت بصورت ذرات ريزی در داخل ستون قرار گرفته است .كه بر اثر چسبيدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرک جداسازی انجام می شود .نمونه ابتدا وارد گاردكالوم و بعد وارد ستون می شود، گارد كالوم را پس از مدتی بايد عوض كرد ODS ،اكتا دسيل سيالن گروههای الكيل غيرقطبی زيادی دارد ،فاز متحركی كه استفاده می كنيم قطبی است .فاز متحرک و ماده پركننده ستون از نظر قطبيت بايد عكس هم باشند .در HPLCامکان استفاده از فاز نرمال و معكوس هست .اگر فاز ثابت قطبی و فاز متحرک غيرقطبی باشد سيستم را فاز نرمال و در صورتي كه ستون غيرقطبی و حالل قطبی باشد .سيستم را فاز معكوس می گويند .مشتقات آلكيل سيالن و فنيل سيالن ايجاد ستونهای غير قطبی می كنند و معموال ستون غير قطبی و فاز متحرک قطبی است بنابراين از فاز معكوس استفاده می شود .جنس ستونها از فوالد ضدزنگ يا Stainless steelاست 17 تصاویری از چند ستون 18 -5رديابها: رديابها بايد حساس باشند و اثر مخرب بر روی اجسام نداشته باشند .پاسخ آنها تا حدود وسfيعی برای غلظت بايد خطی باشد .انواع رد یاب ها: بffنفشfسfتکffه بffراfیاfجfسامfیكه در نfاحfيه UV-VISجfذب ا ‏fيابfاورا - a مfهمترينآنfها رد م ‏fذبنfجام مfیشffود و بffاعثكاسfته داfشfته بffاشfند مfورد اfسfتفادfه fقfرار مfیگffیرد.در اfيندfتfكتور ج اf ‏fتfيزاfنكاسfته شffدناfنرژfیمfتناسfب ‏fلfندازfه fگffيریاfس .م شffدناfنرژfیمfیشffود كه اfينكاسfته شffدنقfاب ا ‏fلffبايد در طfول ‏fتحfال ن ،بffايد طfولمfوج را مfشخصكنيم كه در اfينجا nm l=225اfس . اfسfتبffا غfلظت مfوج اfنfتخابfیجfذبداfشfته بffاشد. ‏b . ردياب ضريب شكست ،اين ردياب خيلی حساس به حرارت است.از تغييرات يا تفاوتی كه بين ضريب شكست سيستم حالل به تنهايی و سيستم حالل همراه نمونه ايجاد می شود استفاده می كنيم. ‏fصرفfیبffاشد چfونمfوادfیكه خfاصfيت م .c دfتfكتور فffلورfسانfسحfساستffر از UVاfسfتوfلfیكم م فffلورfسانfسداfشfته بffاشfند كم هfستند. ‏d . ردياب الكتروشيميايي كه عملکرد آن بر مبنای fواکنش های اکسید و احیا می باشfد. 19 تصویر آشکارساز 20 -6ثبات (ركوردر): : در اثر حركات قلم پيک هایی رسم می شود كه به مجموعه آنها كروماتوگرام می گويند. به طريق كيفی پيک ها را براساس زمان باز داری يا نگهداری يا Retention timeمی شناسند .زمان بازداری فاصله زمانی از لحظه تزريق تا رسيدن به نقطه اوج يک پيک است .برای محاسبه كمی سطح هر نوار جذبی را حساب می كنيم ،سطح هر نوار جذبی متناسب با مقدار جسم است كه بوسيله انتگراتور يا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست مي آيد سطح هر نوار جذبی يعنی حاصلضرب قاعده × نصف ارتفاع است .روش بريدن نوار و وزن كردن آنها روش قديمی است .ولی امروزه توسط سطح سنج يا انتگراتور بدست مي آيد خود دستگاه AUCرا مشخص مي كند .می توان از ارتفاع هم استفاده كرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص كنيم AUCو ارتفاع با يک دستور ساده قابل تبديل بهم هستند .روش رسم منحنی را انجام می دهيم .در محور افقی غلظت ها و در محور عمودی . AUCبعد از رسم منحنی استاندارد ،غلظت مجهول را از روی رسم منحنی بدست می آوريم. 21 انواع کروfماتوگرافی ‏کروماتوگرافی تقسیمی ‏کروماتوگرافی تبادل یونی ‏کروماتوگرافی جذب سطحی ‏کروماتوگرافی طردی 22 کروماتوگرافی تقسیمی کروماتوگرافی تقسیمی در بین چهار نوع روش کروماتوگرافی مایع بیشتر از همه به کار برده شده است .در گذشته اکثر کاربردها به ترکیبات نایونی ,قطبی با وزن مولکولی کم و یا متوسط معموال کمتر از 3000 مربوط بوده است .ولی اخیرا روشهایی ابداع شده اند ( مشتق سازی و زوج یونی ) که جداسازیهای تقسیمی را به ترکیبات یونی نیز بسط داده اند. به علت اینکه جداسازی در LLCبه میزان تقسیم اجزای مخلوط بین دو فاز مایع بستگی دارد این نوع کروماتوگرافی را کروماتوگرافی تقسیمی می نامند. 23 کروماتوگرافی تبادل یونی در کروماتوگرافی تبادل یون از رزین های تبادل کننده ی یون به عنوان فاز ساکن استفاده می شود .رزین ها ,پلیمرهای سنتزی با اتصاالت جانبی هستند که پیوندهای کواالنسی و گروههای عاملی یونی شونده می باشند .در رزین های تبادل کننده کاتیون گروههای آنیونی و در رزین های تبادل کننده آنیون گروههای کاتیونی وجود دارند. یون مخالف یعنی یون متصل به رزین تقریبا آزاد است و می تواند در فاز متحرک آبی حل شود و درون ستون جریان یابد 24 کروماتوگرافی جذب سطحی در روش hplcاز سیلیکای اصالح نشده استفاده می شود .مکانهای جذب روی سطح سلیکا ,سیالنول می باشند .در کروماتوگرافی با سیلیکا تعداد نسبی هر نوع از گروههای سیالنول بستگی به نوع سلیکا و چگونگی تهیه و مراقبت از آنها دارد.معموال برای کروماتوگرافی ,سیلیکا توسط حرارت دادن در 150تا 200 سانتیگراد فعال می شود و سپس توسط فاز متحرک و میزان کمی از آب یا حالل آلی قطبی دیگر به مقدار جزئی غیر فعال شده تا میزان و جذب آن در حد استاندارد گردد. با وجود سیلیکا و فاز متحرک غیر قطبی که با میزان کم حالل قطبی تعدیل شده ,الیه ای از مواد قطبی روی سطح سیلیکا جذب می شود. 25 کروماتوگرافی طردی روشی است که مولکولها برمبنای اندازه موثر و شکل آن در محلول از یکدیگر جدا می شوند .و اگر از حاللهای آلی استفاده کنیم این روش اغلب کروماتوگرافی ژل تراوا و اگر از حاللهای آبی استفاده نمائیم آن را کروماتوگرافی ژل صافی می نامند. فاز های ساکن مورد استفاده در کروماتوگرافی طرد ذرات متخلخل با اندازه منافذ کنترل شده می باشند .و نباید بین جزء نمونه و سطح فاز ساکن برهم کنش موجود باشد .حجم کل فاز متحرک درون ستون عبارت است از مجموع حجمی که خارج از ذرات فاز ساکن می باشد. 26 مزایای این روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد باال سریعترین رشد را در بین تمام فنون جداسازی تجزیه ای با فروش سالیانه در گستره میلیارد دالر داشته است . و دلیل این محبوبیت: -1حساسیت روش - 2سازگاری آن برای انجام اندازه گیریهای کمی صحیح - 3مناسب بودن آن برای جداسازی گونه های نافرار یا ناپایدار گرمایی -4کاربرد گسترده آن برای مواد پراهfمیت در صنعت -5زمینه های مختلف علوم و جامعه 27 موارد استفاده ازHPLC: ‏ ‏ ‏ ‏ 28 جداسازی ،خالص سازی و شناسائی پروتئین ها و ترکیبات آلی بویژه ترکیبات دوائی .همچنین در برخی از آزمایش های مربوط به تعیین غلظت دواها مورد استفاده قرار می گیرد . در تحقیقات پروتومیک (تحقیقاتی که برروی پروتئین ها انجام می شود) ،آنالیز و هضم پروتئین مقایسه ساختارهای پروتئین های مختلف تعیین ساختار پلیمرها با تشکر 91/2/21 29