کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
اسلاید 1: موضوع بحث: کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
اسلاید 2: سرفصل ها1- توضیحی در مورد کروماتوگرافی2- میدان عمل HPLC3- کاربردهای کروماتوگرافی مایع4-انواع کروماتوگرافی5- توضیحات کلی در مورد پمپها6- کارایی ستون در کروماتوگرافی مایع7- آشکارسازها
اسلاید 3: توضیحی در مورد کروماتوگرافیکروماتوگرافی لغتی یونانی به معنی رنگ نگاری است که ترکیبی از دو واژه کروما به معنی رنگ و گروفین به معنی نوشتن است. در سال 1903 برای اولین بار از این روش جداسازی مواد رنگی استفاده شد که این کار توسط میخائیل‌سوئت انجام گرفت. اما امروزه از این روش برای جداسازی مواد بی رنگ چون گازها استفاده میشود یکی از پرکاربردترین روش‌های جداسازی مواد در آزمایشگاه کروماتوگرافی است و در مواقعی که جداسازی به روش‌های دیگر ناممکن است به راحتی میتوان از این روش استفاده کرد، زیرا اختلافات‌های جزئی موجود در رفتار اجسام باعث تسهیل جداسازی در جریان عبور آنها از یک سیستم کروماتوگرافی میشود. این روش بسیار ساده و سریع است به طور مثال آزمایشی که ممکن است با استفاده از روش ستون تقطیر چندین روز به طول بینجامد، می‌تواند به کمک کروماتوگرافی در عرض زمانی بسیار کوتاه انجام گیرد، وسایل مورد لزوم آن نیز ارزان قیمت است.
اسلاید 4: تصویری از دستگاه HPLC
اسلاید 5: شمایی از دستگاه HPLC
اسلاید 6: میدان HPLCفاز ساکن : فاز ساکن در HPLC در ستون هایی از جنس فولاد ضد زنگ به طول 10 -15-25-30-50- و یا 100 سانتی متر و با قطر 2-6 میلی متر پر می شود. عوامل موثردر انتخاب فاز ساکن HPLC عبارتند از : طبیعت مواد مورد تجزیه – راندمان جداسازی مورد نیاز – ظرفیت بارگذاری ستون .از جاذب های جامد به عنوان فاز ساکن جهت جداسازی مولکولهای با جرم مولکولی نسبتا کم و با قطبیت کم استفاده می شود.سیلیکاژل متداولترین فاز ساکن جامد مورد استفاده در HPLC است آلومین , جامد جذاب دیگری است که در HPLC به کار می رود و چون یک ترکیب قلیایی است مواد اسیدی را بر روی خود نگه می دارد.
اسلاید 7: فاز متحرکعموما فاز متحرک حاوی مخلوطی از حلالهای قطبی نظیر الکل و غیر قطبی نظیر هیدروکربنها است. با کنترل ترکیب و قطبیت فاز متحرک در روش گرادیان حلال می توان زمان و حجم باز داری مواد را در ستون HPLC کنترل نمود.فاز متحرک در HPLC باید چنان انتخاب شود که در آشکار ساز مزاحمت ایجاد نکند . معمولا مخلوطهای متانول , اتانول یا پروپانول با هپتان و کلروفرم با هپتان را به عنوان فاز متحرک در HPLC مورد استفاده قرار می دهند. در HPLCفاز معکوس عموما از مخلوط متانول یا استونیتریل با آب به عنوان فاز متحرک استفاده می شود.
اسلاید 8: مزایای این روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا سریعترین رشد را در بین تمام فنون جداسازی تجزیه ای با فروش سالیانه در گستره میلیارد دلار داشته است . و دلیل این محبوبیت:1- حساسیت روش 2- سازگاری آن برای انجام اندازه گیریهای کمی صحیح3- مناسب بودن آن برای جداسازی گونه های نافرار یا ناپایدار گرمایی4- کاربرد گسترده آن برای مواد پراهمیت در صنعت5- زمینه های مختلف علوم و جامعه
اسلاید 9: کاربرد های کروماتوگرافی مایعبرای مواد حل شده ای که وزن مولکولی بزرگتر از 10000 دارند کروماتوگرافی طردی برای گونه های یونی با وزن مولکولی پایین کروماتوگرافی تبادل یونیگونه های کوچک قطبی اما نایونی از کروماتوگرافی تقسیمیو برای جداسازی گونه های ناقطبی , ایزومرهای ساختاری و دسته ترکیباتی از قبیل هیدروکربنهای آلیفاتیک از الکلهای آلیفاتیک از کروماتوگرافی جذب سطحی استفاده می کنند.
اسلاید 10: انواع کروماتوگرافیکروماتوگرافی تقسیمیکروماتوگرافی تبادل یونیکروماتوگرافی جذب سطحیکروماتوگرافی طردی
اسلاید 11: کروماتوگرافی تقسیمی کروماتوگرافی تقسیمی در بین چهار نوع روش کروماتوگرافی مایع بیشتر از همه به کار برده شده است. در گذشته اکثر کاربردها به ترکیبات نایونی, قطبی با وزن مولکولی کم و یا متوسط معمولا کمتر از 3000 مربوط بوده است. ولی اخیرا روشهایی ابداع شده اند ( مشتق سازی و زوج یونی ) که جداسازیهای تقسیمی را به ترکیبات یونی نیز بسط داده اند. به علت اینکه جداسازی در LLC به میزان تقسیم اجزای مخلوط بین دو فاز مایع بستگی دارد این نوع کروماتوگرافی را کروماتوگرافی تقسیمی می نامند.
اسلاید 12: کروماتوگرافی تبادل یونیدر کروماتوگرافی تبادل یون از رزین های تبادل کننده ی یون به عنوان فاز ساکن استفاده می شود. رزین ها, پلیمرهای سنتزی با اتصالات جانبی هستند که پیوندهای کوالانسی و گروههای عاملی یونی شونده می باشند. در رزین های تبادل کننده کاتیون گروههای آنیونی و در رزین های تبادل کننده آنیون گروههای کاتیونی وجود دارند. یون مخالف یعنی یون متصل به رزین تقریبا آزاد است و می تواند در فاز متحرک آبی حل شود و درون ستون جریان یابد
اسلاید 13: کروماتوگرافی جذب سطحیدر روش hplc از سیلیکای اصلاح نشده استفاده می شود. مکانهای جذب روی سطح سلیکا , سیلانول می باشند. در کروماتوگرافی با سیلیکا تعداد نسبی هر نوع از گروههای سیلانول بستگی به نوع سلیکا و چگونگی تهیه و مراقبت از آنها دارد.معمولا برای کروماتوگرافی , سیلیکا توسط حرارت دادن در 150 تا 200 سانتیگراد فعال می شود و سپس توسط فاز متحرک و میزان کمی از آب یا حلال آلی قطبی دیگر به مقدار جزئی غیر فعال شده تا میزان و جذب آن در حد استاندارد گردد. با وجود سیلیکا و فاز متحرک غیر قطبی که با میزان کم حلال قطبی تعدیل شده , لایه ای از مواد قطبی روی سطح سیلیکا جذب می شود.
اسلاید 14: کروماتوگرافی طردیروشی است که مولکولها برمبنای اندازه موثر و شکل آن در محلول از یکدیگر جدا می شوند. و اگر از حلالهای آلی استفاده کنیم این روش اغلب کروماتوگرافی ژل تراوا و اگر از حلالهای آبی استفاده نمائیم آن را کروماتوگرافی ژل صافی می نامند. فاز های ساکن مورد استفاده در کروماتوگرافی طرد ذرات متخلخل با اندازه منافذ کنترل شده می باشند. و نباید بین جزء نمونه و سطح فاز ساکن برهم کنش موجود باشد. حجم کل فاز متحرک درون ستون عبارت است از مجموع حجمی که خارج از ذرات فاز ساکن می باشد.
اسلاید 15: انواع پمپ1- پمپ های پیستونی2- پمپهای جابه جایی یا سرنگی3- پمپ های فشار ثابت یا بادی
اسلاید 16: سیستم های پمپ کننده
اسلاید 17: ویژگی سیستم های پمپ کننده تولید فشارهای تا PSi600 خروجی بدون تپ سرعت جریان در گستره 1/0 تا ml/min10کنترل جریان و تکرارپذیری جریان تا 5/0% نسبی ویا بهتراجزای سازنده مقاوم در مقابل خوردگی (فولادهای مختلف زنگ نزن یا تفلون)
اسلاید 18: عملکرد پمپ وظیفه اصلی پمپ در کروماتوگرافی مایع این است که فاز متحرک را بافشار بالا باسرعت عبور کنترل شده , از ستون عبور دهد. یک نوع پمپ ( پمپ با فشار ثابت این عمل را با آوردن فشار ثابت به فاز متحرک انجام می دهدو سرعت عبورازستون با توجه به مقاومت ستون در برابر عبور جریان و مقاومتهای دیگر موجود بین پمپ آشکارگر تعیین میشود. نوع دیگر این کار را با عبور جریان در حد خواسته شده انجام می دهد و در اینجا میزان فشار با توجه به مقاومت در برابر عبور تنظیم می گردد.
اسلاید 19: انواع ستون ستون های کروماتوگرافی مایعستون های تجزیه ایستون های محافظ
اسلاید 20: ستون های کروماتوگرافی مایعاین نوع ستون ها معمولا از لوله های فولاد زنگ نزن با منفذ یکنواخت ساخته می شوند , گرچه لوله های شیشه ای یا جداره ضخیم نیز گاهی به کار می روند . لوله های شیشه ای با فشارهای کمتر از psi 600 محدود می شوند.
اسلاید 21: ستون های تجزیه ایطول اکثر ستونهای کروماتوگرافی مایع 10 تا 30 سانتیمتر است. معمولا ستونها مستقیم اند و قطر داخلی ستونهای مایع اغلب 4 تا 10 سانتیمتر است و متداولترین ذرات پرکننده ها 5 و 10 میکرومتر است. متداولترین ستون در حال کار این روزها , ستونی با طول 25 میکرومتر پرشده است. و این ستونها می توانند 40000 تا60000 بشقابک در متر دارد.
اسلاید 22: تصاویری از چند ستون
اسلاید 23: ستون های محافظاغلب یک ستون کوتاه محافظ قبل از ستون تجزیه ای به کار می رود تا با حذف نه تنها مواد آلاینده ها از حلالها , بلکه همچنین اجزای نمونه که بطور برگشت ناپذیر با فاز ساکن پیوند می دهند,عمر ستون تجزیه ای را افزایش دهد. همچنین در این روش ستون محافظ برای سیر کردن فاز متحرک با فاز ساکن به کار می رود تا اتلاف این حلال در ستون تجزیه ای را به حداقل برساند. اندازه ذرات در ستون بزرگ است تا افت فشار را به حداقل برساند.
اسلاید 24: انواع پر کننده های ستونپرکننده ذرات پوسته دارپرکننده متخلخل
اسلاید 25: توضیح ذرات پوسته داراز دانه های شیشه ای یا بسپاری نامتخلخل کروی با قطر نوعی از 30 تا 40 میکرومتر تشکیل شده است و جنس لایه متخلخل سیلیس , آلومین و یا یک رزین تبادل یونی روی سطح این دانه ها رسوب داده شده است. ممکن است دانه ها در اثر اعمال شیمیایی دارای سطحی آلی شوند. اخیرا پرکننده های پوسته دار عمدتا در ستون های محافظ و نه برای ستونهای تجزیه ای به کار می روند.
اسلاید 26: توضیح پرکننده متخلخلاین نوع پر کننده ها از ریز ذراتی با قطری در گستره 3 تا 10 میکرومتر تشکیل میشود برای یک اندازه معین تلاش میشود تا گستره اندازه ذره به حداقل برسد.این ذرات از سیلیس –آلومین و یا رزین تبادل یونی تشکیل شده اند که سیلیسی متداول تر است. ذرات سیلیس از تجمع ذرات سیلیس ریز میکرون در شرایطی سنتز می شوند که به ذرات بزرگتر کاملا یکنواخت منجر شوند
اسلاید 27: آشکارسازهاعامل وجودی آشکارگر در hplc, آشکار کردن فاز متحرکی است که از ستون بیرون می آید. یک سری گسترده از وسایلی که بعضی از آنها پیچیده و حساس هستندبه عنوان آشکارگر مورد استفاده قرار می گیرند. آشکار سازها به دو گروه اصلی آشکار سازهای با خاصیت گروهی و آشکارسازهای با خاصیت جسم حل شده طبقه بندی میشوند.
اسلاید 28: تعریف دو نوع اصلی آشکارسازآشکارسازها با خاصیت گروهی : به خاصیت فاز متحرک مانند ضریب شکست ثابت دی الکتریک یا چگالی که با وجود جسم حل شده مدوله میشودجواب میدهند.آشکارسازها با خاصیت جسم حل شده: به خاصیتی از جسم حل شده مانند جذب UV – فلوئورسانس یا جریان نفوذ , که فاز متحرک فاقد آن است جواب میدهد.
اسلاید 29: مشخصات آشکارساز ایده آلعلاوه بر اینکه آشکار سازها در این روش نیازی ندارد به گستره ای به آن وسعت ازدما جواب بدهد. علاوه براین برای کاهش پهن شدگی منطقه , آشکار ساز HPLCباید حداقل حجم درونی را داشته باشدحساسیت کافی پایداری خوب و تکرار پذیر قابلیت اعتماد بالا و سهولت کاربردزمان جواب کوتاه که مستقل از سرعت جریان است.
اسلاید 30: انواع آشکارسازآشکارسازهای جذبیآشکارسارهای فلورسانسیآشکارسازهای ضریب شکستآشکارسازهای الکتروشیمیایی
اسلاید 31: آشکار ساز های جذبیآشکارگرهای جذب UV عمومی ترین آشکارگرHPLC به حساب می آیند. اصولکارکرد آن براین مبناست که فاز متحرک از ستون به درون محفظه ای کوچکجاری میشود. محفظه در مقابل اشعه uv/visible منتشر شده از دستگاه نورسنجیاطیف سنج قرار میگیرد. این آشکارگرها انتخابگر بوده , فقط میتوانند اجزاء نمونه ایاز نور uv را جذب می کنند آشکار سازند. و برای به حداقل رساندن پهن شدگینواراضافی ستون , حجم چنین سلولی را تا حد امکان کوچک نگه می دارد.بنابراین حجمها به 1تا 10 میکرو لیتر و طول سلولها به 2 تا 10میلی لیتر محدودمیشوند.
اسلاید 32: تصویری از یک آشکارساز
اسلاید 33: آشکارسازهای فلورسانسیبسیاری از مواد میتوانند نورuv را جذب کرده و سپس اشعه ای در طول موج بالاترپخش کنند. این پخش یا سریعاصورت میگیرد( فلورسانس) یا باکمی تاخیر (فسفرسانس) و معمولا نور جذب شده که دو مرتبه در طول موج بالاتر پخش میشودبسیارکم است. اما برای بعضی مواد این میزان بین 1/0 تا1 می باشد. و این روش برایآشکار شدن این مواد مناسب میباشد . موادی که بطور طبیعی خاصیت فلورسانسیدارند دارای ساختمان حلقوی مزدوج هستند.
اسلاید 34: تصویر آشکارساز
اسلاید 35: آشکار سازهای ضریب شکست این آشکارگر برمبنای اختلاف ضریب شکست جزء نمونه خارج شده از ستون ضریب شکست فاز متحرک خالص ( به عنوان شاهد) بنا نهاده شده است. تا زمانی کهمابین جزء نمونه و فاز متحرک اختلاف شکست نور موجود باشد میتوان گفت که اینآشکارگرها نزدیکترین وسیله در HPLC به عنوان آشکارگر جامع می باشند.
اسلاید 36: آشکارساز ضریب شکست
اسلاید 37: آشکارگرهای الکتروشیمیاییآشکارگرهای الکتروشیمیایی , هدایت مواد شسته شده را اندازه می گیرند و یا جریان بوجود آمده توسط اکسایش و احیاء جزء نمونه را تعیین می کنند در حالت اول جزءنمونه باید یونی باشد و در حالت دوم جزء نمونه باید براحتی اکسید یا احیاء گردد. نوعاول را آشکارگرهای سنجش رسانایی ویژه گویند .
اسلاید 38: تصویری از آشکارساز
اسلاید 39: منابعشیمی دستگاهی زیر نظر دکتر علی معصومیکروماتوگرافی مایع با بازدهی عالی - سندی لیند سیاصول تجزیه دستگاهی جلد2
نقد و بررسی ها
هیچ نظری برای این پاورپوینت نوشته نشده است.