صفحه 1:
~= ۵ ۰ 6
KK مون کشت فد «
بل 7 اس
صفحه 2:
صفحه 3:
489 ott
تکنولوژی سلولی و مهندسی ژنتیک زمینههای اصلی بیوتکنولوژی نوین را تعيين كرده |
و شامل روشهایی میباشند که در ترن بیستم بهطور وسیع توسعه يافته و در بسیاری از
کشورها مورد استفاده قرار گرفتهاند.
" بیوتکنولوژی
علمی مشتمل بر روشها و تکنیکهای تولید. ذخیرهسازی و فرایندهای کشاورزی و
همچنین محصولات دیگری که مواد زیستی معمولی و غیرتراریخته OLS
حیوانات و ریزسازوارهها را در شرایط طبیعی و مصنوعی به کار میبرند
بیوتکنولوژی سلولی بر ویژگی خاص سلول از قبیل خاصیت توتیپوتنسی سلول.
توانایی باززایی یک موجود کامل از آن و همچنین قابلیت سنتز متابولیتهای ثانویه
باارزش از این سلولها بنیان نهاده شده است و از این طریق:
صفحه 4:
معا 22
محصولات جدید را از طریق ee به
ای زنده و غیرزنده
افرایش تولید و کیفیت محصولات کشاورزی
ریزازدیادی ژنوتیپهای باارزش
عاریسازی گیاهان از ویروسها و ویروئیدها
٠ دستیابی به مواد فعال بیولوژیکی جهت اهداف پزشکی و تغذیهای
صفحه 5:
تکاملی پی
مرحله اول (۱۸۹۲-۱۹۰۲)
" هاپرلند ون وچینگ و رشینگر کشت بافتهای گیاهان مختلف در
محلولهای نمکی ناپ و غنی از ساکارز
' هابرلند . فرضیهای در مورد حاصیت توتیپوتنسی هر سلول گیاهی زنده
٠ قابلیت سلولهای گیاهی به واقعیت بخشیدن پتانسیل نمو خود جهت
تشکیل یک گیاه کامل در شرایط خاص کشت بود پدر علم کشت
بافت گیاهی
صفحه 6:
ow ع
مرحله دوم (۱۹۰۲-۱۹۲۲)
تهیه محیط کشتهای اولیه جهت کشت بافتهای حیوانی با منشاء طبیعی داشتند |
و حاوی پلاسمای خون و مایع جنینی
مرحله سوم (۱۹۲۲-۱۹۳۲)
09 دانشمند آمریکایی و کوته دانشمند آلمانی امکان کشت مریستمهای .
انتهابى نوك ريشه كوجه فرنكى و ذرت بر روى محيط كشتهاى جامد
مرحله جهارم (1985-1940)
گاتریت. دانشمند فرانسوى امكان كشت موفق و مداوم بافتهاى كياهى هويج
را در شرایط درون شیشهای با انتقال متناوب آنها بر روى محيط كشتهاى تازه
تا نت ما ارت
5
صفحه 7:
تسر ی هه
" وایت 2 برروی توتون
" نابکرت . اولین کشت بافتهای واقعی و طولانى مدت از بافتهاى تمايز
يافته هویج
مرحله پنجم (۹۶۰-۱۹۲۰)
کشف کلاس جدیدی از هورمونهای گیاهی به نام سیتوکینینها و بهخصوص
هورمون کینتین در سال ۱۹۵۵ امکان تحریک تقسیم سلولهای برش يافته بافت
پارانشیم میانی توتون
مرحله ششم (1۹7۰-۱۹۷۵)
SSS | روشهای آنزیمی جهت تهیه پروتوپلاستهای منفرد حاصل از
ریشه و میوه گوجه فرنگی و کشت آنها در شرایط کنترل شده
بت باس مان
٠". بو
صفحه 8:
| باور و همكاران 2 امتزاج مصنوعی پروتوپلاستها . باعث
گشودهشدن راه جدیدی در ایجاد هیبریدهای سوماتیکی
" مورل دانشمند فرانسوی استفاده از ریزازدیادی گناهان در شرایط درون
شیشهای با استفاده از کشت مریستم جهت تهیه مواد گیاهی عاری از بیماری
در گیاه ارکیده
٠ مرحله هفتم (۱۹۷۵ تا کنون)
توسعه فناوریهای درون شیشهای
تهیه انواع مواد بیولوژیکی مورد نیاز جهت انجام کارهای کشت بافت
صفحه 9:
4 ow
روشهای امتزاج الکتریکی (الکتروفیوژن) پروتوپلاستهای منفرد. روشهای
جهشزایی و سلکسیون سلولی
٠ روشهای دست یابی به گیاهان هاپلوئید
" روش کشت سلولی با استفاده از پروتوپلاستها و ناقلین ساخته شده بر اساس
پلاسمیدهای 11 و 181 مربوط به اگروباکتریوم تومفیشین و اگروباکتریوم
رایزوژنز
روشهای موثر انتقال ژن به كياهان
توسعه روشهای صنعتی کارهای مربوط به بافتها و سلولهای منفرد گیاهان
صفحه 10:
ایش و تکثیر درون شیشهای سلولها بر
اساس خاصیت توتیپوتنسی و باززایی آنها پایهریزی ميشود.
در بیوتکنولوژی از روشهای کشت بافتهای گیاهی بر روی محیطهای غذایی
مصنوعی در شرایط استریل (درون شیشهای) جهت نگهداری و تکثیر ژنوتیپهای
باارزش, جتینزایی؛ تکتیر قلمهها و غیره استفاده مکنند.
بررسی نقش کشت سلولها و بافتها در بیوتکنولوژی در سه زمینه:
سلولهای گیاهی منفرد قابلیت تولید متابولیتهای ثانویه باارزشی از قبیل آلکالوئیدهاء
استروئيدهاء كليكوزيدهاء هورمونها. روغنهای فرار و غیره جهت استفاده در
مصارف پزشکی, عطرسازی. لوازم آرایشی و... بهطور کنی؛ متابو لیتهای
ثانويه را از بافتهاى كالوس رشد يافته بر ووى محیطهای غذایی جامد (محیط
آكار) يا مایم (کشت سوسپانسیون) بدست میاورند.
wey
صفحه 11:
استفاده از کشت بافت برای تکثبر و عاریسازی مواد گیاهی از عوامل بیماریزا از
استفاده از سلولهای منفرد در سلکسیون گیاهانی جهت تولید گیاهان سریعالرشد
متحمل به عوامل نامطلوب محیطی مختلف از قبیل خشکی. شوری. درجه حرارتهای
پایین و بالاه عوامل بیماریزای گیاهی, فلزات سنگین و غیره
امکان بدست آوردن گیامان طبیعی از طریق امتزاج پروتوپلاستهای گیاهی تهیه
دورگهای غیرجنسی (هیپریدهای سوماتیکی) انتقال ژنهای خارجی به
پروتوپلاستهای گیاهی از طریق روشهای مهندسی ژنتیک تولید گیاهانی با
حصوصیات توارثی جدید ایساد هاپلوشدها از طربی کشت بساک و تخمک بر روی
محیطهای غذایی مصنوعی, کشت جنین جهت تولید دورگهایی با رشد نامطلوب
ع كه از قدرت زندهمای زر تولید پذر مناسب برخوردار نیستند. باروری درون
صفحه 12:
صفحه 13:
اصول کلی کشت سلول و بافت
محط کشت موره اسفاده در کشت بافت بستر عذابی غنی و عالی جهت وشد و
گسترش میکروارگانیسمها بوده و قطعات جدا شده از گیاهان (ریزنمونهها) که بر
روی این محیطهای غذایی قرار میگیرند. به سرعت توسط میکروارگانیسمها آلوده
میگردند
رعایت شرایط دقیق استریلیزاسیون
کلیه مراحل کشت و همچنین انتقال ریزنمونهها بر روی محیطهای کشت تازه در
محلهای ضد عفونی شده قابل کنترل (لامینار اير فلو) همراه با ابزارهای استریل
صفحه 14:
ضد عفونی ریزنمونهها و بذور
قرار دادن آنها به مدت۵ تا ۲۰ دقيقه در محلولهای استریل کننده
چندین مرتبه شستشوی ریزنمونهها با آب مقطر استریل
مدت زمان استریل کردن به خصوصیت (جنس) ریزنمونه و فعالیت محلول
استریل کننده بستگی دارد.
استریل کنندههای معمول هييوكلريت سديم» هیپوکلریت کلسیم» آب
اکسیژنه» کلرید جیوه» نیترات نقره
غلظتها و مدت زمانهای ضدعفونی و مقدار دقیق آن بستگی به نوع و
حساسیت ریزنمونه دارد.
“yw
صفحه 15:
محیط کشتها را معمولا به مدت ۲۰ دقیقه در اتوکلاو و با درجه حرارت ۱۲۰ درجه .
سانتیگراد و فشار ۰/۷۵ تا ۱/۱ اتمسفر استریل میکنند.
اگر در ترکیب محیط کشت موادی به کار برده شود که ساختار آنها در اثر درجه
حرارتهای بالا تخریب میشود لازم است که در این موارد از استر بلیزاسیون سرد
استفاده شود. بدین ترتیب که آنها را از فیلترهایی با روزنههایی به قطر ۰/۲۳ تا
۵ میکرون عبور داده و سپس زمانی که درجه حرارت محیط کشت پایه اتوکلاو
شده به ۶۰ درجه سانتیگراد رسید, به آن اضافه کرد.
صفحه 16:
محتویات محیطهای غذایی جهت کشت سلولها و بافتهای منفرد:
عناصر پرمصرف (ازت. فسفر پتاسیم. كلسيم, منيزيم و گوگرد)
pole کممصرف ef el) روی؛ مس, مولیبدن؛ کبالت و...)؛ ویتامینها:
هیدراتهای کربن و هورمونهای گیاهی یا مشتقات مصنوعی آنها باشد.
اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (811) یا نمک طبیعی آن بهبود
قابلیت مصرف آهن برای سلولها تس
برای تهیه بافت کالوس, افزودن شیر نارگیل (آندوسپرم مایع دانخل میوه
ا ا و لط عت
صفحه 17:
هیدراتهای کربن از اجزای ضروری محیطهای غذایی مورد استفاده در کشت
بافت محسوب میگردند.
از آنجایی که در اکثر موارد سلولها و بافتهای بهکار رفته بهعنوان ریز نمونه,
اتوتروف تحواهط بود از ساکارز با کلوکر با غلظت ۲ با ۲ درصد بهعوان
منبع هیدرات کربن استفاده میکنند.
هورمونهای گیاهی برای تمایززدایی سلولها و القای تقسیمات سلولی مورد نیاز
هستند.
جهت القای ریختزایی ساقه مقدار اکینهای موجود در محیط کشت را میتوان
تقلیل داد و یا اينکه به طور کلی از محیط کشتها حذف نمود.
صفحه 18:
از ۲۶- دی کلرو فنوکسی استیک اسید (۲,۶- 60 آلفا لياق أميا
(27۵۵) ایندول-۳- استیک اسید (18۵) و با مشتقات مصنوعی دیگر آنها به
عنوان منابع اکسین در محیط کشتها استفاده ميکنند.
همچنین در محیطهای کشت مصنوعی از ۰ بتریل آمینو پورین
زاتین بهعنوان منابع سیتو کینین استفاده میکنند.
بیش از همه در کشت بافتهای گیاهی در شرایط درون شیشهای از محیط
کشت 1۷5 استفاده میشود که ترکیب آن اولین بار در سال ۱۹۲ توسط
thy و اسکوگ معرفی گردید.
صفحه 19:
تعادل مواد غذایی در این محیط کشت به خوبی در تهیه محیط کشتهای جامد
معمولا از آگار استفاده میشود:
پلیساکاریدی است که از نوعی گیاه دریابی بدست میاید.
اکثر بافتهای کالوس به دلیل اينکه کلروپلاست ندارند و هتروتروف هستند,
احتیاجی به نور نخواهند داشت.
با اين وجود در اکثر مواقع» بافتهای کالوس را در تاریکی و یا در نور خیلی
ضعیف بدست میاورند.
بافتهای تعیین هویت شده از لحاظ ریختشناختی را به نور منتقل نموده و سپس آنها
را در شرایط نوری ۱۰۰۰ تا ۳۰۰۰ لوکس رشد میدهند.
صفحه 20:
کشت مریستمهای تشکیل شده و تکثیر آنها نیز در شرایط نوری انجام میشود.
با توجه به نوع کشت. شدت نور اتاقکهای رشد باید بین ۱۰۰۰ تا ۳۰۰۰
لوکس. رطوبت در اتاقک رشد باید بین 7۰ تا ۷۰ درصد باشد.
بهترین رژیم دمایی نوری و همچنین رطوبت بهینه را میتوان به کمک اتاقک
رشد فراهم نمود. درجه حرارت مناسب ASI EES chy بافتهای گیاهی ۲۵ تا
درجه سانتیگراد است.
در کشت بافت گیاهان مناطق حارهای» درجه حرارت اتاقک رشد را
ممکن است تا ۲۹ تا ۳۰ درجه سانتیگراد افزایش دهند» در حالی که
جهت القای ریختزایی درجه حرارت را تا ۱۸ تا ۲۰ درجه سانتیگراد
بايين ميآورند.
نمايش فیلم شماره ۱و شماره ۲
يد
صفحه 21:
كشتكلوس ۶
كشت كالوس
در کشت بافتهای گیاهی. در اكثر موارد بافت كالوس توليد ميشود و بافتهاى غدهاى
بندرت ديده ميشوند.
٠ كالوس يك بافت سازمان نيافته و در حال تقسيم ميباشد كه از سلولهاى تمايز نيافتهاى
تشكيل شده است. در مراحل بعدىء اين سلولها اختصاصى كرديده به طورى كه به
كالوسهايى تبديل ميشوند كه از أنها تييهاى خاصى متمايز ميشود.
٠ کالوس میتواند هم بر روی قطعات بافتهای مجزا (ریزنمونهها) در شرايط درون شيشهاى
و هم بر روی گیاهان در
صفحه 22:
کشت »وس ۲۱
٠ بافت کالوس در شرایط درون شیشهای معمولا سفید یا زرد و گاهی اوقات به رنگ سبز
روشن میباشد. این بافت خیلی بندرت میتواند رنگدانههای سبز پررنگ نیز به خود بگیرد
(به عنوان مثال در گیاه ماندراگورا).
< رنگدانه قهوهای تیره اغلب پهخاطر پیری سلولهای کالوس پروز میکند و مربوط به
تجمع ثتل در آنها است. . . برای جلوگیری از این حالت؛ به محیطهای کشت.
آنتياكسيدان میافزایند.
a
3
صفحه 23:
معمولا بافت کالوس حالت بیشکل دارد و نمیتواند ساختار آناتومیکی مشخصی داشته
باشد» ولی بسته به منشاء پیدایش و شرایط کشت ممکن است از نظر استحکام»
ساختارهای متفاوتی به خود بگیرد:
) حالت متورم که شامل سلولهای شدیدا آبکی است و به آسانی به واحدهای مجزای
کوچک تقسیم میشود و از هم میپاشد؛
۲) ساختاری با استحکام متوسط همراه با پیدایش مراکز مریستمی مناسب؛
۳ ساختار ضخیم (مستحکم) که در آن عناصر کامبیوم و سیستم آوندی تمایز میبابند.
صفحه 24:
روند تشکیل و رشد بافت کالوس
٠ شرط ضروری تمایززدایی سلولهای گیاهی و تبدیل آنها به بافت کالوس؛ وجود دو گروه
از هورمونهای گیاهی در محیط کشتها شامل اکسینها و سيتوكينينها ميباشد.
اکسینها موجب تمایززدایی سلولها میگردند و آنها را برای تقسیم آماده میکنند. در حالی
که سیتوکینینها باعث تکثیر (تقسیم) سلولهای تمایززدایی شده میگردند.
اگر در محیط کشت بدون هورمون. قطعهای از ساقه برگ, ريشه (بدون کلاهک) یا هر
ریزنمونه گیاهی دیگری حاوی سلولهای تمایز یافته قرار گیرد. هیچ تقسیم سلولی اتفاق
نمیافتد و بافت کالوس تولید نميشود.
این حالت مربوط به عدم قابلیت تقسیم سلولهای تمایز يافته
صفحه 25:
5
هر سلول سه فاز رشدی را طی میکند: ۱) تقسیم؛ ۲) رشد؛ ۳) تمایز,
خصوصیت ویژه فاز نهایی رشد. ضخیم شدن غشای ثانویه سلولی و از دست دادن
قابلیت تقسیم سلول میباشد. جهت اينکه سلولهای تمایز یافته دوباره قابلیت
تقسیم را پدست آورند. ضروری است دوباره حالت تمایز نیافته به خود گیرند که در
اين حالت سلولها به حالت مریستمی برمیگردند.
که در نتیجه آن بافت کالوس تشکیل میشود. . تبدیل سلول تخصصی شده به
کالوس مربوط به القای تقسیم سلولی است که سلول در طول روند تمایز خود این
قابلیت را از دست داده است.
تهیه کالوس از ریزنمونههای مختلف از قبیل: قطعات ساقه. ريشه» برگ. گلبرگ و
صفحه 26:
در پارانشیم میانی توتون . فقدان سیتوکینینها در محیط کشت. چرخه سلولی را در دوره
شروع تقسیم میتوز متوقف میکند.
بنابراین اگر در محیط کشت فقط اکسین وجود داشته باشد. سلولها تقسیم نمیشوند و
چهار روز پس از مرحله پنهان (کمون-کند اولیه) مستقیما وارد فاز رشد میشوند.
وجود هورمون سیتوکینین بدون حضور اکسینها منجر به تولید همان بافت قدیمی
پارانشیم میانی توتون میشود. مانند اینکه بر روی محیط کشت بدون هورمون قرار گرفته
باشند.
صفحه 27:
ننایج بدست آمده در خصوص پارانشیم میانی توتون هميشه نمیتواند پیانگر تمام مواردی ۰
باشد که به تشکیل بافت کالوس بر روی محیط کشت حاوی یک نوع هورمون مربوط
oo
٠ به عنوان مثال» تولید کالوس بر روی محیط کشت حاوی ,9-۲ بدون حضور
کینینها در جنینهای نارس گندم و پا بدست آوردن کالوس از بافتهای کوتیلدونی
آفتابگردان بر روی محیط کشت حاوی سیتوکینین بدون حضور اكسين؛ از جمله اين
موارد میباشند.
در بسیاری از موارد. نتایج حاصله بستگی به هورمونهای درونی دارد که در سلولهای
ریزنمونه موجود است و اين از ویژگیهای خاص هورمونی آنها محسوب ميشود.
پلیساکاریدها و انواع دیگری از محرکها به جز اکسینها و سيتوکينينهاه نیز باعث تقسیم
سلولها و در نتیجه حرکت به سمت تولید کالوس میشوند.
صفحه 28:
روند گذر به سمت رشد کالوس در بخش قاعده نوک ساقهچه با توقف تقسیمات
سلولی آغاز ميشود.
فاز پنهان ۲۶ تا ۶۸ ساعت به طول میانجامد. در طول این مدت سلولها از نظر اندازه
بزرگ میشوند و بافت نرم و متورم میگردد.
پس از فاز پنهان. سلولها با تشکیل بافت کالوس شروع به تقسیم با نرخ رشد زیاد
تاثیر هورمونهای گیاهی باشد. با این وجود. عدم تمایز سلولهای مریستمی در حال
تقسیم» به توقف تقسیمات سلولی سلولهای غبر تخصصی مربوط بوده و فقط پس از
این مرسثه است که القای تقسیمات سلولی: سنجر به کالوسرایی ete
صفحه 29:
Wet
٠ اثر مربوط به عمل یک یا چند هورمون گیاهی ممکن است بسته به خصوصیت
فیزیولوژیکی بافت مورد نظر متفاوت باشد که توانایی آن در نمونههای مورد مطالعه؛ بر
| رای رل ها مر
گاهی در شرایط درون شیشهای گذر سلول از حالت تمایزیافته به حالت تمایززدایی
شده همراه با تقسیمات سلولی فعال. تغییر فعالیت برخی از ژنها همراه است که از چنین
تغییراتی تحت عنوان تغییرات اپیژنتیک نام میبرند.
فعال کردن یکی از ژنها و از کار انداختن فعالیت ژنهای دیگر موجب تغییر در ترکیب
پروتئینی سلولها ميشود. در سلولهای کالوس. پروتئینهای اختصاصی تظاهر مییابند و
همزمان میزان پروتئینهای ویژه جهت سلولهای فتوسنتر کننده برگ کاهش مییابد و پا از
ee
صفحه 30:
روند از کار افتادن یا شروع مجدد فعالیت ژنهای مبتنی بر خاصیت تمایززدایی: در
گیاهان دولپه راحتتر از گیاهان تکلپه اتفاق میافتد.
در هنگام تبدیل سلولهای تمایززدایی شده به حالت تكثير بيقاعده سازمان نيافته که منجر ۲
به تولید بافتهای کالوس میشود. تغییرات بیوشیمیایی و سیتولوژیکی در سلولها روی
میدهد.
حالت تمایززدایی با استفاده از مواد اندوختهای و تخریب اندامکهای سلولی تخصصی
شروع میشود.
1 تا ۱۲ساعت پس از القای حالت تمایززدایی, دیواره سلولى نرم شده و متورم میشود.
تعداد ریبوزومهای آزاد تعداد واحدهای دستگاه گلژی و همچنین اندازه و تعداد
صفحه 31:
تمام این تغییرات قبل از شروع تقسیمات سلولی كه ب rei
ميبيوندد» اثفاق ميافتد. Ss el © در رباك ترج کت مور
متابولیسم ناشی از حالت تمایززدایی و همچنین سنتز محل آسیب دیده در سلولهای 7
ریزنمونه مشاهده شود.
سلولهای کالوس چرخه تکثیر خود را ادامه داده و پس از آن که حالت پیری و مرگ
سلولها فرا میرسد. تکثیر هر یک از سلولها دوباره در حالتهای تقسیم, رشد و تمایز
تکرار ميشود. تمایز کالوس را میتوان تمایز ثانویه نامید. ولی نباید آن را با تمایز ثانویه
سلول که مبتنی بر پایه ریختزایی است. اشتباه گرفت.
جهت اینکه مراحل پیری؛ از دست دادن قابلیت تقسیم سلولی و مرگ سلولهای کالوس
nice ow i ee es
نتقال می دهند. این عمل زیرکشت نامیده ميشود.
صفحه 32:
کش تاه |
wh ۹
در صورتی که عمل واکشت به صورت منظم انجام گیرد. قابلیت تقسیم سلولی ممکن
است دهها سال حفظ شود.
منحنی رشد سلولهای کالوس حالت ٩ شکل دارد که شامل پنج مرحله مختلف میباشد:
٠ در مرحله اول رشد که فاز پنهان (کمون-کند) اولیه نامیده میشود. هیچ گونه
افزایشی در تعداد يا جرم سلولها اتفاق نمیافتد. در اين مرحله؛ سلولها جهت شروع
تقسیم آماده میشوند.
مرحله دوم. رشد لگاریتمی یا تصاعدی سلولها است که مشخصه اصلی آن.
بیشترین فعالیت تقسیم سلولی و افزایش جرم کالوس است. علاوه بر آن رشد با
حداکثر سرعت اتفاق میافتد.
صفحه 33:
. در مرحله سوم. که فاز خطی است. نرخ رشد سلول ها ثابت میشود. در اين مرحله ٠
تقسیم سلولی کند گردیده ولی هنوز افزايش توسعه سلولی مشاهده ميشود.
مرحله چهارم با حالت ثابت شدن رشد سلولها همراه است و زمانی اتفاق میافتد كه
فعالیت میتوزی سلولها (هم سرعت تقسیم و هم توسعه سلولی) به طور واضح
کاهش مییابد.
در مرحله پنجم که فاز سکون (توقف) نامیده میشود. منحنی رشد رو به سراشیبی
میرود. در این دوره کاهش سرعت رشد سلولها شروع گردیده اما با وجود آن. به
دلیل تفسیم سلولها هنوز افزایشی در تعداد آنها مشاهده میگردد. ولی در مجموع.
افزایش جرم سلولی پرابر صفر است. پس از مرحله توقف. مرگ سلولها فرا میرسد.
بهطوری که هم تعداد و هم جرم سلولهای زنده کاهش مییابد.
صفحه 34:
صفحه 35:
ویژگیهای سلولهای کالوس
سلولهای کالوس در شرایط درون شیشهای خصوصیات فیزیولوژیکی- بیوشیمیایی
مختلفی را که مخصوص سلولهای عادی موجود در ساختمان گیاه است دارا میباشند.
قابلیت سنتز متابولیتهای ثانویه را حفظ صفت مقاومت در برابر سرما و قابلیت آبگیری
برای سلولهای کالوس حاصل از گياهان مقاوم به سرما حالت داشته و قایل
توارث میباشد. واکنشهای دوره نوری نیز که مربوط به حفظ فعالیت فیتوکرومها میباشد,
از خصوصیات ویژه بانتهای کالوس محسوب ميشود.
در سلولهای کالوس و همچنین سلولهای عادی گیاهان. خصوصیات متعدد دیگری نیز
نظیر مقاومت به درجه حرارتهای بالاء مواد با اسمزیته بالا و شوری نیز وجود دارد.
صفحه 36:
7
. علاوه بر آنء سلولهای کالوس یک سری خصوصیات منحصر بهفردی دارند که آنها را از ٠
سلولهای عادی متمایز مینماید.
در آنها پروتئینهای اختصاصی تظاهر مییابند و میزان پروتئینهای مخصوص فتوسنتز
سلولهای برگ نیز کاهش مییابد و یا اینکه به طور کلی حذف میشود.سلولهای
کالوس از نظر ناهمگنی بالای ژنتیکی و غیر همزمانی فیزیولوژیکی نیز از سلولهای
عادی متمایز میشوند. چرخه سلولی در سلولهای کالوس, طولانیتر از سلولهای
كياهان رشديافته در طبیعت است. یکی از ویژگیهای سلولهای کالوس. ناهمگنی
ژنی آنها بر اساس سن بافت کالوس میباشد. همچنین تفاوتهای زیادی در تبادلات
انرژی در سلولهای کالوس مشاهده ميشود. آنها در مقایسه با سلولهای عادی نیاز به
اکسیژن کمتری دارند. این خصوصیت را اولین بار رامسگرن در سال ۱۹۳۸ در
سلولهای مریستمی که به طور فعال در حال تقسیم بودند مشاهده نمود.
صفحه 37:
كشتكلوس ۶
ژنتیک سلولهای کالوس
' مدت زمان زیادی عقیده بر این بود که سلولهای کالوس از نظر ژنتیکی یکنواحت هستند.
در دهه ۱۹۲۰ مشخص شد که سلولهای بافت کالوس ناهمگنی ژنتیکی بالایی را
نشان میدهند. — 1
٠ ناهمگنی ژنتیکی سلولهای کالوس قبل از هر چیز در سطوح بلوئيدى مختلف آنها نمايان
میشود. به طوری که این سلولها بر اساس تعداد کروموزوم از هم متمایز میشوند.
بافتهای مریستمی از نظر در شرایط درون شیشهای پایدار میباشند.
صفحه 38:
در کشتهای کالوس و سوسپانسیون سلولی. گاهی اوقات سلولهای دیپلوئید (حاوی دسته
enc ميد وند که گیاهان حاسل از آها عم رم ای که
گیاهان حاوی سلولهای پلیپلوئید (دارای دستجات ۳ ۵,۶ با بیشتر کروموژومی) دارند.
همچنین در کشت بافت کالوس حاصل از گیاهان پلیپلوئید نیز میتوان بندرت
پلوئیدی (کاهش يا افزایش تعدادی کروموزوم به مجموعه کروموزومی موجود که
دقیقا مضربی از مجموعه کروموزوم هاپلوئیدی موجود نباشد) را نیز مشاهده کرد.
هرچه سلولهای کالوس مدت زمان طولائیتری تحت زیرکشت قرار گرفته باشند. تمایز
آنها بر اساس سطح پلوئیدی, بیشتر خواهد بود.
صفحه 39:
سلولهای پلی پلوئید فاز پنهان (کمون) کوتاهتری دارند و بنابراین سریعتر از سلولهای
دیپلونید وارد مرحله تقسیم میشوند. همچنین این سلولها از نظر بُنیه نیز در مراحل بعدی
زیرکشت نسبت به سلولهای دیپلوئید ارجحیت دارند. در مجموع. اثر متقابل هر دو عامل
تاثیرگذار بوده و شرایط به سمت افزایش سطح پلوئیدی پیش میرود.
علاوه بر تغییر سطح پلوئیدی. کشت سلولها و بافتهای گیاهان در شرایط درون شیشهای
باعث پیدایش شکستگیها و ناهنجاریهای کروموزومی در سلولها میشود.
این وقایع بر روی حصوصیات بیولوژیکی بافتهای کشت شده با تغییر شکل خارجی آنها,
تغییر و تبادل مواد و سرعت رشد تاثیر میگذارند.
در میان نمونههای مشاهده شده در زیر میکروسکوپ. جهشهای کروموزومی را میتوان در
سلولهای کشت شده مشاهده نمود که باعث بروز تغییراتی میشوند که بدون
میکروسکوپ و از روی ظاهر گیاه نمیتوان تشخیص داد.
صفحه 40:
اکسینها و سیتوکینینها از جمله هورمونهایی هستند که در ترکیب محیطهای کشت
کالوسزایی وارد میشوند.
فعالترین ماده هورمونی که در ترکیب اکثر محیطهای کشت بهکار میرود. ماده جهشزای
۲,۶-ظ میباشد.
يتوكينينها و بهخصوص کینتین, امکان پلیپلوئید شدن سلولها را فراهم میسازند.
تنوع ژنتیکی سلولهای کالوس اجازه میدهد که از آنها جهت سلکسیون سلولی برای
مقاومت به عوامل نامساعد محیطی (از قبیل خشکی, شوری, سرماء فلزات سنگین؛
درجه حرارتهای بالا و پایین و غیره) عوامل بیماریزای گیاهی و همچنین افزایش
عملکرد استفاده نماییم.
صفحه 41:
ریختزایی در بافتهای کالوس
راههای دست یافتن به نمو سلولها پس از تمایززدایی آنها
٠ روش اوله باززايى ثانويه كياه 2 تمايز در سطح سلولهاء بافتها يا اندامها
روش دوم. از دست دادن قابلیت تمایز ثانویه سلول و همچنین قابلیت باززایی گیاه
با استفاده از خاصیت تمایززدایی سلولها قابلیت رشد بر روی محیط کشت
بدون هورمون (که همان بازگشت به حالت غدهای است) را بدست میآورند.
روش سوم. شامل چرخه طبیعی نمو سلول کالوسی است که مراحل پیری و مرگ
آن تمام شده است. در این مورد. سلول تمایز ثانویه را تحمل نموده و تقسیم را
متوقف می کند (فاز رشد توقف). با این وجود. چنین حالت تمایزی منجر به
ریختزایی نمیشود و خصوصیات سلولهای کالوس قدیمی را حفظ میکند.
صفحه 42:
ریختزایی در کشت بافت کالوس» عبارت از به وجود آمدن ساتارهای منظم از یک
توده سلولی بیقاعده و نامنظم میباشد.
" دو تیپ اصلی در ریختزایی وجود دارد: در کشت بافت. ریختزایی ممکن است به
حالت اندامزایی (تشکیل ساختار چندقطبی که شامل مجموعهای از اندامهای مجزا
است) از قبيل ريشه. ساقه و بندرت كل يا برك ابتدا اندامهای منفرد را
باززایی نموده و سپس از آنها گياهان کامل تولید میکنند. اندامزایی ريشه از اين
قاعد: اعده مستبتی میباشد؛
| جنینزایی سوماتیکی (تولید ساختارهای شبه a دوقطبی از سلولهای سوماتیکی)
تظاهر نماید. در حالت اندامزایی جنینزایی سوماتیکی, بر حلاف اندامزایی؛
بلافاصله جنین تشکیل میشود که هم دارای مریستم ريشه و هم مریستم جوانه
انتهایی ساقه بوده و در ادامه از آنها گیاه کامل بدست میاید.
سر
صفحه 43:
کش تاه ۲۱
Da 3
قابلیت هر سلول سوماتیکی گیاه برای واقعیت دادن به برنامه نمو نحود جهت تبدیل OF
به یک گیاه کامل را توتیپوتنسی سلول گیاهی مینامند.
" هر سلول سوماتیکی پتانسیل منحصربهفردی را دارا بوده به طوری که حاری تمام
مجموعههای ژنی موجود میباشد و بنابراین تمام سلولها برنامههای ویژه خاصیت نمو را
حفظ میکنند. اگر از سلولهای گلبرگ. پارانشيم میانی ساقه و یا از سلولهای هر
نوع بافتی از گیاه» کالوس بدست آوریم. تحت شرایط خاصی هر یک از سلولهای بافت
کالوس میتواند گیاه کاملی را باززایی نماید.
خاصیت توتیپوتنسی هميشه به واقعیت نمیپیوندهه به طوری که قابلیت بالقوه انواع
مختلف سلولها به صورت یکسان نمایان نمیگردد.
صفحه 44:
زابی سلول را تمایز سلولی تشکیل میذهد.
باززايى كياهان با تمايز ثانويه سلولها آغاز ميدود. در اين هنكام سلولهاى تماد
tye ساعتار و عمل pote ود راید ساورند.
تمایز انویه سلولهای کالوس هميشه با ریختزایی و باززایی گیاه تمام نمیشود. بعضی
اوقات. این روند فقط منجر به تولید بافت میشود که به چنین حالتی تمایز بافتی
میگویند. . سلول کالوس میتواند به عناصر آوند آبکش یا آوند چوبی تبدیل شود.
نمونه دیگر تمایز انویه میتواند تبدیل سلول تمایززدایی شده و دارای حالت تکثیر فعال
به سلول کالوس پیر در فاز توقف باشد که این سلولها قابلیت تقسیم خود را از دست
دادهاند. از بین کلیه حالات تمایز ثانویه بيشترين توجه به ريخت زایی معطوف میگردد.
به طوری که اجازه میدهد از سلول کالوس بتوانیم گیاه کامل بدست آوریم.
صفحه 45:
در قابلیت ریختزایی سلولهای گیاهی. هم عوامل داخلی و هم عوامل خارجی مو
عوامل داخلی: عوامل ژنتیکی گونه گیاهی اولیه, اندامی که از آن ریزنمونه تهیه میشود و
اسن ريزئموته
عوامل خارجی: ترکیب محیط كشتء درجه حرارت و نور (شدت نور و طول دوره
زمانى فتويريود).
شديدترين نوع القاکننده ریختزایی» كه بهتر است آن را تحریککننده یا سیگنال ریخت
زایی نامید. تغییر نسبت بين سیتوکینینها و اکسینهای بهکار رفته در ترکیب محیطهای
کشت میاشد.
در هنكام فزونى سيتوكينينها بر اكسينهاء اغلب اندامزایی ساقه شروع ميشود و غالبيت
اكسينها بر سيتوكينينها باعث ريشه زايى ميكردد.
صفحه 46:
پاید خاطرنشان ساخت. در مواردی که در کشت بافت کالوس ابتدا جوانههای ريشه
تولید شوند. تقریبا هیچگاه گیاه کامل باززایی نمیشود. در حالی که اگر ابندا جوانههای
ساقه تولید گردند» در ادامه (با نتقال به محیط کشت حاوی مقادیر بالاتر اکسین) به
راحتی ریشهدار گردیده و اين آغازی برای تولید گیاه کامل خواهد بود.
ie
واکنشهای مربوط به ریختزایی در بافت کالوس:
الف- تکثیر کالوس؛ a
ب- تولید ساقههای نابجا؛
ج- ریشهزایی در بافت کالوس.
صفحه 47:
بنابراين» اکسینها و سیتوکینینها که بستگی به نسبت آنها یا تحریک کننده خاصیت
تمایززدایی سلولی و تبدیل آنها به فاز رشدی کالوس میباشند و یا اينکه باعث تمایززایی
و ریخترایی در کشت بافتهای کالوس میگردند. نه LB به عنوان تنظیم کنندههای رشد
گیاهی بلکه به عنوان تنظیم کنندههای خاصیت تمایز نیز محسوب میشوند.
بنابراین؛ اندامزایی را میتوان به کمک اکسینها با سیتوکینينها القا کرد. درحالی‌که جنینزایی
سوماتیکی به طور واقعی به هورمونهای گیاهی خارجی مربوط نخواهد بود. اغلب.
مناطق شبه جنینی در بافت کالوس بر روی همان محیط کشتی که برای کالوسزایی به
کار برده شده است ایجاد میشوند. نمو جنینهای سوماتیکی در بافت کالوس زمانی شروع
مشود که عامل تمایرژدایی (2-6 با اکینهای دیگر) از محیط کشت حذف نود.
جنين نمو يافته به هورمونهای خارجی نیازی ندارد زیرا خود. هورمونهای مورد نیازش
صفحه 48:
1 ۳-5
تغیرات نسبت هورموتها در محیط کشت و همچنین عامل تفکیک ملولهای گیامی از هاگ
موجود؛ محرکهای اصلی ریختزایی مباشند.
محرکهای ریختزایی در کشت بافت کالوس: ترکیباتی نظیر نیترات نقرهه ذ
از اسیدهای آمینه (پرولین: تیروزین وبعضی اوقات سرین) و پليأمینها (پوترسین و اسپرمیدین)
در محيط كشث
٠ هانيت و سوربيت نيز روند ريختزايى را تحريك ميكنند. يون هاى 110 بر روى نمو
ساختارهای سازمان یافته تشکیل شده در بافت کالوس تاثیر میگذارند, در حالی که یونهای
sll ‘NH, آنها را تحریک میکنند.
اسید جیبرلیک رشد آغازینهای ساقه را تحریک مینماید» در حالی که اسید آبسیزیک تمایز
جنینهای سوماتیکی را تسریع میکند.
نیترات نقره. قابلیت باززایی را در زیرکشتهای قدیمی تداوم میبخشند.
صفحه 49:
اززایی در همه سلولها صورت نمگیرد ا ل
بای رای مک برای انتقال به ریختزایی, فقط وجود ماده القاکننده (تحریک
کننده) کافی نیست, پلکه لازم است که سلول نیز جهت پاسخ به آن آماده باشد. 1
tells Hie) glen GAGS Sp yh ia Saeco S
و سلولی که چنس فابلیتی را کب نموده است. نحت عنوان ملول توانا نامیده مشود.
ve محتظلايه إن نيجه وسيدحان كه ای لاک اه تصادفی بوده و بتابراین
صفحه 50:
در بعضی مواقع. سلولهای آغازین در فاز کمون واقع میشوند که سازماندهی و
آمادهسازی مجدد آنها جهت تقسیمات سریع بعدی ضروری است.
سپس این سلولها با دو نیم شدن تقسیم شده و تولید توده کروی شکلی از سلولهای
متقارن کوچک مینمایند.
٠ در اندامزايى؛ اين توده سلولى را مرکز مریستمی و در جنینزیی سوماتیکی پیش جنینهای
گلبولی شکل ميتامند.
. در ادامه در مرکز مریستمی. آغازینهای ساقه, ريشه برگ یا جوانه گل تمایز میبابند و بر
طبق آن اندامزایی ساقه ريشه برگ با گل اتفاق میافتد.
در پیش جنین گلبولی شکل ساختار شبه جنینی دوقطبی توسعه مییابد.
صفحه 51:
رال توالی یل ۰ ی هی سول وس با و ان ال
گلبولی شکل, JRE اژدری شکل و سپس جنین سوماتیکی در نظر گرفت. مراکز
مریستمی يا پیش جنینها میتوانند پیرامون بافت کالوس به وجود آیند و یا اينکه در داخل
بافت تشکیل شوند. اغلب. قاعده مشخصی در محل قرار گرفتن آنها مشاهده نمیشود.
ry
استثناء: اندامزایی ساقه در بافت کالوس حاصل از پارانشیم میانی توتون رقم
ويسكانسين 2 مراکز مریستمی همیشه فقط در بخش زیرین توده کالوس واقع
SS ae
صفحه 52:
كشتكلوس ۶
ريختزايى در سلولهاى كالوس به طور دايمى و بيوسته در جريان ميباشد. در بافت
کالوس ممکن است به طور همزمان هم ساعتارهای تشکیل شده به طور کامل و هم
سلولهایی که تازه در مسیر ریختزایی وارد شدهاند, وجود داشته باشند.
2 فعالیت سنتری بسیار زياد سلولهای مراکز مریستمی و پیش جنینهای گلبولی شکل
بهوسیله مرکز انتقالی آنها که هدایتکننده مواد غذایی است. انجام میشود. در این حالت
سلولهای کالوس اطراف آنها اغلب تخریب میشوند و شبه جنینهای تشکیل شده به
آسانی از توده سلولهای کالوس فرو میریزند.
" نمایش فیلم شماره ۲
صفحه 53:
کشت سلول و بافت در بهنژادی گیاهی
یکی از زمینههای فناوری کشت سلولی, استفاده از آنها در بهنژادی گیاهی میباشد که
کاربرد روشهای سلکسیون سنتی را در تهیه لاینها و ارقام جدید گیاهان تسهیل و تسریع
مینماید.
روشهای موجود کشت بافت و سلول در شرایط درون شیشهای:
گروه اول. فناوریهای کمکی که روشهای عادی بهنژادی را تغییر نمیدهند و فقط به
آنها کمک میکنند. تعدادی از این روشها شامل باروری در شرایط درون شیشهای
(رفع خودناسازگاری پروگامی» کشت تخمکها و جنینهای نابالغ دورگها (رفع
خودناسازگاری پست گامی) بدست آوردن هاپلوئیدها از طریق کشت دانههای
گرده و میکروسپور نگهداری سلولها. بافتها و اندامهای منفرد در حالت انجماد و
باززایی دورگهای دور میباشند.
صفحه 54:
5 سلول و رات Wa ىكاى
كروه دوم؛ روشهاى مستقل و غيروابسته به روشهاى سنتى سلكسيون جهت بدست
آوردن لاينها و ارقام جديد كياهان ميباشند. در اين مورد ميتوان به روشهاى سلكسيون
سلولی پا استفاده از بافت كالوسء دورك كيرى غيرجنسى (امتزاج يروتويلاستهاى منفرد
و بدست آوردن دورگهای غیرجنسی) و کاربرد روشهای کشت بافت در مهندسی ژنتیک
اشاره نمود:
استفاده از روشهای درون شیشهای کمکی در بهنژادی گیاهی
٠ در دورگگیریهای دور (دورگ گیری بین والدینی که به لحاظ فیلوژنی از هم دور
هستند)» روشهایی از کشت بافت نظیر باروری در شرایط درون شیشهای. کشت جنین
(کشت جنینهای منفرد بر روی محیط کشتهای مصنوعی). ریزازدیادی دورگهای با
ارزش, بدست Seal هاپلوئیدها به طریق درون شیشهای و همچنین نگهداری در حالت
صفحه 55:
۴ 5 MO rath
باروری در شرایط درون شیشهای (رفع خودناسازگاری پروگامی)
این روش زمانی انجام میشود که امکان باروری بین جفتهای انتخاب شده در شرایط
طبیعی محقق نمیگرده. این عمل به چند علت اتفاق ميافتد: ۱- عوامل فیزیولوژیکی (عدم
تطابق همزمان رسیدگی تخمک و دانه گرده و غیره)؛ ۲- عوامل مورفولوژیکی (کوتاه بودن
لوله گرده یا متوقف شدن رشد آن در مراحل مختلف روند باروری و غیره).
دو مورد از روشهایی که میتوان به باروری در شرایط درون شیشهای نایل گردید. بدین
صورت است: الف- کشت تخمدان بر روی محیط کشت مصنوعی جامد و همزمان با آن
قرار دادن دانههای گرده آماده بر روی آن؛ ب- باز کردن تخمدان و قطعات جفت همراه با
تخمکهای محصور شده در آن و قرار دادن آنها بر روی محیط کشت در مجاورت دانههای
گرده و يا قرار دادن مستقیم دانههای گرده آماده بر روی بافت جفت کشت شده.
صفحه 56:
ss ۹ MO rath
رفع خودناسازگاری پُستگامی
خودناسازگاری پست گامی در مورد دورگ گیریهای دور پس از مرحله باروری بروز
میکند. اعلا رای ات لور ات رتلی ضعيفى تولید میشوند که عامل آن میتواند
انحرافات ایجاد شده در زمان نمو جنین و اندوسپرم باشد. به دلیل رشد ضعیف اندوسپرم»
قر وه نی ار تب دای مراد چس رده ورسعف رالات و
آن را بر روی محیط غذایی مصنوعی کشت مینمایند.
پرورش جنین (نابالغ يا بالغ) بر روی محیط کشت مصنوعی در شرایط درون شیشهای.
کشت جنین نامیده ميشود.
محیط غذایی مورد نیاز جهت کشت جنین بالغ میتواند ساده و بدون افزودن هر گونه ماده
فعال فیزیولوژیکی باشد به عنوان مثال. میتوان از محیط کشت وایت و یا هر محیط کشت
یگری که حاوی نمکهای معدنی و ساکارز باشد. استفاده نمود.
صفحه 57:
الت سلول و رات Wa ىكاى
درتلاقیهای خیلی دور جلوكيرى از نمو جنين ميتواند حتى در مراحل ابتدايى مشاهده
شود كه در فقدان تمايز و كاهش سرعت رشد تظاهر مییابد. در اين مورد. كشت جنين
از دو مرحله تشكيل ميشود:
رشد جنين در حالت امبريونى» زمانی که هنوز تمایز آن ادامه میبابد (سخت ترین
حالت از نظر ترکیب محیط کشت در نظر گرفته میشود که باید حاوی مقادیر بالای
ساکارز همراه با افزودن اسیدهای آمینه. ویتامین ها و هورمونهای گیاهی مختلف
باشد)
رشد جنین جوان در زمانی که مرحله تمایز آن خاتمه یافته است.
صفحه 58:
5 سلول و رات Wa ىكاى
كشت جنين؛ به عنوان يك روش كمكى در مورد دورك كيريهاى دور نه تنها در برطرف ١
نمودن خودناسازگاری پست گامی, بلکه به منظور ریزازدیادی دورگهای با ارزش نیز به
کار میرود.
در این مورد. ریزازدیادی از طریق کالوسزایی, القای ریخت زایی و تهیه گیاهان باززایی
شده از بافت کالوس انجام ميشود.
فناوری همسانه سازی جنینهای نارس اجازه میدهد که ژنوتیپهای با ارزش گیاهان در
مراحل اولیه دوره زندگی خود تکثیر شوند.
یکی دیگر از کاربردهای اساسی کشت جنین گیاهی. استفاده از آن در سلکسیون سلولی
مسا
صفحه 59:
ریزازدیادی دورگهای دور
روش کشت جنین. امکان رشد گیاهان دورگ حاصل از دورگگیریهای دور را از طریق
کشت جنینهای ناقص آنها میسر میسازد. با این وجود. كياهان دورگ حاصله کوچک و
اغلب آنها عقیم میباشند.
تکثیر و نگهداری گیاهان حاصله یکی از مسایلی است که همواره در پیش روی محققان
فرار داشته است.
در این موارد. میتوان از روشهای ریزازدیادی در شرایط درون شیشهای کمک گرفت.
دورگهای حاصل از دورگگیری دور را میتوان از روشهای فعال سازی نمو مربستم
جوانههای جانبی (یا تکثیر ساقههای (pate استفاده از جوانههای نابجاء باززایی گیاهان از
elisa) قدي ادر Cop ester yeaa نود
صفحه 60:
جمعآوری دانههای
گرده از پایههای
Sos ویو
گونههای مختلف از
خانواده بید و نمونهگیری
از پایههای مورد نظر
صفحه 61:
صفحه 62:
<< Orci
2ه
—
سد
=k 1۳
*. = h
Ese ee
اندازهگیری تعداد جنین و طول و عرض تخمدان و جنین
شكل جنينهاى حاصله ٠
شکل ظاهری برگها
59 یت
لا
صفحه 63:
