آنتی بیوگرام

آنتی بیوگرام

اسلاید 1: In the name of GodYasouj University of Medical SciencesDepartment Of MicrobiologyAntibiogramBy:Dr. S. S. KhoramroozDepartment of Microbiology, Faculty of Medicine, Yasuj University of Medical Sciences, Yasuj, Iran

اسلاید 2: آنتی بیوگرامبررسی تعیین حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک های مورد استفاده و شناسایی مقاومت در باکتریهاعدم نیاز به بررسی حساسیت در بعضی باکتریهااسترپتوکوکوس پایوژنزانجام تست در باکتریهایی که ژنهای مقاومت را کسب میکنندانتروباکتریاسهسودوموناساستافیلوکوکوسانتروکوکوساسترپتوکوکوس پنومونیه3/13/2018S. S. Khoramrooz2

اسلاید 3: آنتی بیوگرام آنتی بیوگرام:تعیین حساسیت یا مقاومت میکروبها نسبت به مواد ضد میکروبی در آزمایشگاهروشهای مختلف: Broth-Macrodilution (tube-Dilution) Tests Broth-Microdilution TestsAgar-Dilution TestsE-testDisk Agar Diffusion3/13/2018S. S. Khoramrooz3

اسلاید 4: Broth-Microdilution Tests3/13/2018S. S. Khoramrooz4

اسلاید 5: A broth microdilution susceptibility panel containing 98 reagent wells and a disposable tray inoculator.Reller L B et al. Clin Infect Dis. 2009;49:1749-1755© 2009 by the Infectious Diseases Society of AmericaBroth-Microdilution Tests

اسلاید 6: Antimicrobial susceptibility testing using micro-broth dilutions•••••••••••••96 well microtiter plateug/ml64 32 16 8 4 2

اسلاید 7: 3/13/2018S. S. Khoramrooz7MICThe lowest concentration of antibiotic that prevented growth represented the Minimal Inhibitory Concentration.MBCMinimal Bactericide Concentration

اسلاید 8: 3/13/2018S. S. Khoramrooz8E- test

اسلاید 9: A Staphylococcus aureus isolate tested by the Etest gradient diffusion method with vancomycin (VA), daptomycin (DM), and linezolid (LZ) on Mueller-Hinton agar.Reller L B et al. Clin Infect Dis. 2009;49:1749-1755© 2009 by the Infectious Diseases Society of AmericaE- test

اسلاید 10: روش دیسک آگار دیفیوژن Disk Agar Diffusion تهیه سوسپانسیون میکروبی خالص برابر با کدورت استاندارد مک فارلند استفاده از سواب جهت انتقال سوسپانسیون به محیط کشت مولر هینتون و پخش آن در سطح محیط کشت قرار دادن دیسک های حاوی آنتی بیوتیک در سطح محیط کشت انکوباسیون در دمای مناسببررسی نتایج و تفسیر3/13/2018S. S. Khoramrooz10

اسلاید 11: تهيه كدورت استاندارد نيم مك فارلند1- هدف:جهت استاندارد کردن غلظت تلقيح براي آزمايش تعيين حساسيت ميكروبي، استفاده از استاندارد سولفات باريم (BaSo4)، برابر با استاندارد نيم مک فارلند2- مواد و ابزار لازم:کلرور باريم دهيدراته، اسيدسولفوريک، مزور، بالن ژوژه، لوله آزمايش در پيچ دار استريل

اسلاید 12: 3- روش انجام کار:استاندارد نيم مک فارلند سولفات باريم به روش زير تهيه مي شود :0/5 میلی لیتر از کلرور باريم ((BaCl2) mol/l 0/048 ) (2H2O . W/VBaCl21/175% 5/ 99 میلی لیتر اسيد سولفوريکmol/l 0/18 (V/V 1%) اضافه کنيد و با هم زدن مداوم سوسپانسيون بدست آوريد.2) چگالي صحيح کدورت استاندارد با استفاده از اندازه گيري جذب در اسپکترو فتومتر با طول مسیر نوري cm1، مشخص شود. جذب در nm625 بايد بين 0/08 تا 0/13 باشد.

اسلاید 13: 3) سوسپانسيون سولفات باريم بايد به مقدار ml6-4 در لوله هاي در پيچ دار هم اندازه با لوله هاي سوسپانسيون باکتريايي ريخته شود.4) درب اين لوله ها بايد محکم بسته شوند و نگهداری در دماي اتاق و در تاريکي .5) همزدن استاندارد سولفات باريم قبل از هر بار استفاده به شدت (ترجيحا با ورتکس مکانيکی)، جهت ايجاد کدورت يکنواخت. در صورت مشاهده ذرات بزرگ، بايد استاندارد تازه اي تهيه گردد. 6) استاندارد سولفات باريم بايد به صورت ماهانه جايگزين شود يا جذب آن اندازه گيري گردد.

اسلاید 14: Dr. S. S. Khoramrooz14

اسلاید 15: Antimicrobial discs Stocks of antimicrobial discs should preferably be kept at -20 ∞CA small working supply of discs can be kept in the refrigerator for up to 1 monthTurbidity standard0.6 ml of a 1% (10 g/l) solution of barium chloride dihydrate into a 100-ml graduated cylinder,filling to 100ml with 1% (10 ml/l) sulfuric acid. The turbidity standard solution should be placed in a tube identical to the one used for the broth sample. It can be stored in the dark at room temperature for 6 months.3/13/2018S. S. Khoramrooz15

اسلاید 16: روش دیسک آگار دیفیوژن Susceptibility Testing MethodsInnoculateMH platePlace diskson agar plateIncubate plate18-24 hr, 35 CMeasure and record zone of inhibition around each disk

اسلاید 17: Disk Diffusion Susceptibility TestingImproper agar & disk placementMueller Hinton agar & good disk placementUse Mueller Hinton agar

اسلاید 18: اندازه گیری قطر منطقه تعیین حساسیتاندازه گیری قطر هاله عدم رشد حساس (Sensitive; S) نیمه حساس (Intermediate; I) مقاوم (Resistant; R) 3/13/2018S. S. Khoramrooz18

اسلاید 19: 3/13/2018S. S. Khoramrooz19

اسلاید 20: 3/13/2018S. S. Khoramrooz20

اسلاید 21: 3/13/2018S. S. Khoramrooz21

اسلاید 22: Antimicrobial discs Stocks of antimicrobial discs should preferably be kept at -20 ∞CA small working supply of discs can be kept in the refrigerator for up to 1 monthTurbidity standard0.6 ml of a 1% (10 g/l) solution of barium chloride dihydrate into a 100-ml graduated cylinder,filling to 100ml with 1% (10 ml/l) sulfuric acid. The turbidity standard solution should be placed in a tube identical to the one used for the broth sample. It can be stored in the dark at room temperature for 6 months.3/13/2018S. S. Khoramrooz22

اسلاید 23: 3/13/2018S. S. Khoramrooz23

اسلاید 24: Quality control Standard procedure for quality controlStandard strains for quality controlThese tests should preferablybe run every week, or with every fifth batch of tests, and, in addition, every time a new batch of Mueller–Hinton agar or a new batch of discs is used.3/13/2018S. S. Khoramrooz24

اسلاید 25: Preparing the inoculumThe cultures may be inoculated into any type of broth, and incubated until the broth is turbid. Each broth should be streaked onto an agar plate and incubated overnight. Single colonies should then be picked off and submitted to susceptibility tests.Placing antimicrobial discsAfter the inoculum has been streaked on to the plates, the appropriate discs should be applied. The discs to be selected for each control strain .3/13/2018S. S. Khoramrooz25

اسلاید 26: Reading the plates After 16–18 hours incubation, the diameters of the inhibition zones should be measured with a ruler and recorded, together with the date of the test, on a special quality control chart.When the results consistently fall outside the acceptable limits, actionGrossly aberrant results, which cannot be explained by technical errors in the procedure, may indicate contamination or sudden changes in the susceptibility or growth characteristics of the control strain. If this occurs, a fresh stock strain should be obtained from a reliable source.hould be taken to improve the quality of the test.3/13/2018S. S. Khoramrooz26

اسلاید 27: کنترل کيفيت ديسک هاي آنتي بيوتيک جهت انجام آزمايش تعيين حساسيت ميکروبي به روش disk diffusion agar27Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 28: هدف هدف از برنامه کنترل کيفي پايش و ارزيابي موارد زير مي باشد:صحت و دقت روش انجام آزمايش تعيين حساسيت مواد و وسايل به کار برده شده در اين آزمايشعملکرد افرادي که آزمايش را انجام داده و نتايج بدست آمده را قرائت مي نمايند. به منظور دست يابي بهينه به اين اهداف در دسترس داشتن سويه هاي کنترل کيفي تهيه شده از مراکز معتبر ضروري است. 28Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 29: سويه هاي کنترل کيفي پيشنهادي توسطCLSI عبارتند از:Enterococcus faecalis ATCC 29212Escherichia coli ATCC 25922Escherichia coli ATCC 35218Haemophilus influenzae ATCC 49247Haemophilus influenzae ATCC 49766Klebsiella pneumoniae ATCC 700603Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853Staphylococcus aureus ATCC 25923Streptococcus pneumoniae ATCC 4961929Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 30: E.coli ATCC 35218 فقط به عنوان يک ميکروارگانيسم کنترلي براي ترکيبات ممانعت کننده بتالاکتاماز، مثل ترکيبات حاوي کلاولانيک اسيد، سولباکتام يا تازوباکتام پيشنهاد مي شود. Enterococcus faecalis ATCC 29212 (يا E.faecalis ATCC 33186) براي ارزيابي محيط مولر هينتون آگار با ديسک تري متوپريم/ سولفامتوکسازول استفاده مي شود. درمحيط کشت قابل قبول، هاله عدم رشد واضحي به قطر mm 20 يا بزرگتر ايجاد مي شود در حاليكه در محيطهاي کشت غير قابل قبول، هاله عدم رشد ايجاد نمي شود يا در داخل هاله، رشد کم مشاهده مي شود و يا هاله اي با قطر کمتر از mm 20 ايجاد ميگردد. اين کار به منظور بررسي مقادير غيرقابل قبول تيميدين در محيط کشت مزبور است. 30Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 31: Enterococcus faecalis ATCC 29212 همچنين براي کنترل ديسکهاي آمينو گليکوزيد با دوز بالا به کار مي رود.Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 به عنوان يک سويه کنترلی براي آزمايشات ESBL به کار برده مي شود. 31Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 32: کنترل کيفيت قطر هاله عدم رشد سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکيسويه هاي کنترل کيفي را بايد به روش استاندارد آزمايش disk diffusionو با استفاده از همان مواد و روشي که براي سويه هاي جدا شده از نمونه هاي کلينيکي استفاده مي شود آزمايش و نتايج را با جداول 3 و A3 CLSI ( ضميمه 3) مقايسه و بررسي نمود. محدوده قطر هاله عدم رشد قابل قبول براي هر سويه کنترلي نسبت به يک ديسک آنتي بيوتيکي در جداول فوق فهرست شده است. 32Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 33: چنانچه تغيير در ميانگين قطر هاله عدم رشد ناشي از خطا در روش انجام آزمايش نباشد، احتمالا ناشي از تغيير در حساسيت ذاتي باکتري نسبت به آن آنتي بيوتيک مي باشد. در اين صورت لازم است کشت تازه از سوش کنترل تهيه شود. 33Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 34: آزمايش کنترل کيفيت را بايد درچه فواصل زماني انجام داد؟الف _ انجام آزمايش روزانه براي هر سويه کنترلي با يک ديسک آنتي بيوتيکي بايد 20 روز متوالي آزمايش تعيين حساسيت انجام و نتايج با مقادير قابل قبول اشاره شده در جداول فوق مقايسه گردد. بر اساس ضريب اطمينان 95% تنها يک مورد از 20 نتيجه قرائت شده مي تواند خارج از محدوده كنترل باشد (به ضميمه 2مراجعه کنيد). چنانچه بيشتر از يک مورد خارج از محدوده کنترل باشد نياز به اقدامات اصلاحي خواهد بود، که در ادامه توضيح داده مي شود. 34Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 35: ب _ انجام آزمايش هفتگي - در صورتيكه تنها يک مورد از 20 نتيجه قطر هاله عدم رشد براي هر سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي خارج از محدوده قابل قبول مندرج در جداول 3 وA 3 ( ضميمه 3) قرار گيرد ، کنترل کيفي روزانه را به هفتگي تغيير دهيد (به ضميمه 2 مراجعه کنيد). - آزمايش کنترل کيفي هفتگي را يکبار در هفته و هم چنين زمانيکه يکي از عوامل آزمايش (مانند سري ساخت آگار يا ديسکهای تهيه شده از يک سازنده) تغيير کند، انجام دهيد. اگر هر يک از نتايج کنترل کيفي هفتگي خارج از محدوده قابل قبول باشد، انجام اقدامات اصلاحي مورد نياز است . 35Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 36: اقدامات اصلاحي (Corrective actions)الف نتايج خارج از محدوده قابل قبول به دليل خطاهاي مشهود و واضح شامل:استفاده از ديسک اشتباهاستفاده از سويه کنترلی اشتباهآلودگي واضح سويه استفاده غيرعمدی از دما و شرايط اشتباه انکوباسيون بوجود آمده است . دراين حال بايد دليل ايجاد خطا مکتوب و پس از اصلاح آزمايش دوباره تکرار شود . اگر نتايج گزارش شده در محدوده مورد نظر قرار گرفت ، عمليات اصلاحي بيشتري مورد نياز نمي باشد . 36Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 37: ب _ عامل ايجاد نتايج خارج از محدوده کنترل نامشخص است. در اين حال بايد اقدامات اصلاحي فوري بشرح زير انجام شود.آزمايش را جهت يک سويه کنترلي / ديسک آنتي بيوتيکي براي 5 روز متوالي تکرار و همه نتايج را ثبت کنيد. اگر اندازه هر 5 قطرهاله مطابق جداول 3 و A3 ( ضميمه 3) و در محدوده قابل قبول باشد ، عمليات اصلاحي بيشتري مورد نياز نمي باشد. اگر اندازه هر يک از 5 قطر هاله عدم رشد خارج از محدوده قابل قبول باشد ، به عمليات اصلاحي اضافي نياز است. آزمايشهاي کنترلي روزانه بايد ادامه داده شود تا به دليل نهايي مشکل پي برده شود. 37Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 38: عمليات اصلاحي اضافي:وقتي عمليات اصلاحي فوري مشکل را حل نکرد، احتمالا خطاي مشاهده شده بعلت بروز يك اشکال کلي در سيستم و نه يک خطاي تصادفي ايجاد شده است. در اين حالت بايد موارد بيشتري بررسي شوند. مانند:اندازه گيري و ثبت صحيح قطر هاله هاي عدم رشد رعايت تاريخ انقضا و شرايط نگهداري ديسکها و مواد مورد استفاده (دور از رطوبت و در دماي مناسب)38Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 39: مناسب بودن دما و اتمسفر انکوباتور تغييرنيافتن يا آلوده نبودن سويه هاي کنترل مطابقت صحيح سوسپانسيون تلقيح با استاندارد نيم مک فارلند استفاده از پليت کشت تازه برای تلقيح (پليت کشت بايد تازه بوده و مدت زمان انكوباسيون آن بيشتر از 24 ساعت نباشد)وقتي مشکل بر طرف شد، می‌توان کنترل کيفي هفتگي را برقرار کرد. 39Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 40: نگهداري ديسکهاي آنتي بيوتيکي- ديسکها بايد در يخچال˚C 8 و پايين تر ، يا در فريزر˚C 14- و پايين تر تا زمان مصرف نگهداري شوند. - تمامي ديسکهاي گروه بتالاکتام مانند پني سيلين، آمپي سيلين، کربني سيلين، تيکارسيلين، اگزاسيلين و نسل اول، دوم و سوم سفالوسپورين ها و ... بايد در فريزر نگهداري شوند، و فقط مي توان مقداري از آن را بر اساس کار روزانه آزمايشگاه حداکثر به مدت يک هفته در يخچال نگهداري نمود. - بعضي آنتي بيوتيکهاي حساس مثل ايميپنم ، سفاکلر و ترکيبات کلاولانيک اسيد يا سولباکتام اگر تا هنگام مصرف در فريزر نگهداري شوند، پايداري بيشتري خواهند داشت. - ديسکها بايد در ظروف داراي درپوش محکم و حاوي مواد جاذب رطوبت نگهداري شوند. - ديسکهای آنتي بيوتيکي بايد يك تا دو ساعت قبل از استفاده از يخچال يا فريزر خارج شوند تا به درجه حرارت اتاق برسند. 40Dr. S. S. Khoramrooz

اسلاید 41: Detection Strategy: step 1Screen Enterobacteriaceae with :Cefpodoxime- best general ESBL substrateCefotaxime & ceftazidime- good substrates for CTX-M & TEM/SHV, respectivelyDr.T.V.Rao MD41

اسلاید 42: Combination disk method Carter MW et al: J Clin Microbiol 2000; 38: 4228 - 4232Difference > 5 mmDr.T.V.Rao MD42

اسلاید 43: ESBL Confirmatory TestPositive for ESBLCeftaz/CACefotax/CACeftazCefotax43Dr.T.V.Rao MD43

اسلاید 44: روش شناسایی استافیلوکوکوس مقاوم به متی سیلینمولر هینتون همراه با 2% نمکدیسک اگزاسیلین 1 میکروگرمیDr. S. S. Khoramrooz44

اسلاید 45: پايانDr. S. S. Khoramrooz45