اندازه گیری هموگلوبین A2

اندازه گیری هموگلوبین A2

اسلاید 1: اندازه گیری هموگلوبین A2

اسلاید 2: مرکز تحقیقات آزمایشگاه های رفرانسدکتر خداوردیان

اسلاید 3: يكي از تست هاي تشخيصي مهم جهت تأئيد وجود بتا تالاسمي مينور تعيين درصد هموگلوبينA2 مي باشد . روش پيشنهادي با استفاده از كروماتوگرافي تعويض يونيMicro column است. كروماتوگرافي تعويض يوني از انواع كروماتوگرافي هاي مايع – جامد بوده كه بر اساس واكنش متقابل گروههاي باردار مولكول هموگلوبين و رزين ، جداسازي صورت مي گيرد. بر روي رزين يونهايي وجود دارد كه قابل تعويض با يونهاي همبار خود در هموليزات مي باشند. در اين روش از رزين آنيونيك دي اتيل امينواتيل سلولزDEAE52 استفاده می شود

اسلاید 4: اندازه گيري هموگلوبين buffer resin filter------------- -- -

اسلاید 5: ------------------- -- همولیزاتHb A2Hb A+ - Hb A2+ رزین انیونیک DE52 تمایل به گرفتن بار منفی دارد . PH بافر ورزین پاین تر از IPهموگلوبین A2 A2 در این PH بار مثبت پیدا می کند به صورت حلقه جدا میشود+

اسلاید 6: اساس روش: تورم رزين با بافر و به تعادل رسيدن آن با بافر تا PH رزين به PH بافر برسداضافه نمودن هموليزات به ستون جداسازي انتخابي اجراي نمونه بوسيله تغيير PH یا قدرت يونيك بافر ** در اندازه گيري هموگلوبين A2 به روش كروماتوگرافي ستوني مي توان از بافر گلایسين يا بافر تريس استفاده نمود.

اسلاید 7: * رعايت نكات زير در هنگام اندازه گيري هموگلوبين A2 توصيه مي گردد : 1- در صورتي كه ژل داخل ستونها تغيير رنگ داده باشند نبايد مورد استفاده قرار گيرند 2- قبل از استفاده ازستونها و بافر بايد حتما به دماي اتاق برسند. 3- بهتر است از پي پت پاستور تميز و يا سمپلربا نوك نو جهت مخلوط نمودن رزين داخل ستونها با بافر و حل شدن حبابهای هواي داخل رزين استفاده نمود. 4- ستونها بايد از يك Flow rate مناسب برخوردار باشند 1ml/4min،10-20ml/hour

اسلاید 8: 5- قبل از تهيه هموليزات بايد نمونه خون تام كاملا مخلوط شود 6-پس ازتهيه هموليزات بهتراست سريعتركروماتوگرافي انجام شود ( پس از ليز كامل گلبول هاي قرمز ) 7- قبل از نمونه گذاري به هيچ وجه نبايد رزين خشك شود. به محض اينكه محلول روِیی رزين خارج شد بايد هموليزات به ستون اضافه شود. 8-از سمپلر کالبیره باید جهت برداشت نمونه خون، بافرو همولیزات استفاده نمود.

اسلاید 9: 9-باید از لوله های مدرج استاندارد جهت جمع اوری هموگلوبین A2 از ستون و تهیه لوله توتال استفاده نمود.در صورت عدم دسترسی به لوله های فوق لوله های معمولی را به روش دستی (قلم الماس ،ماژیک) مدرج نمائید. 10- افزودن هموليزات بايد به آرامي و درست در سطح رزين صورت گيرد و سطح آن نبايد در هنگام نمونه گذاري آسيب ببيند. 11- بهتراست از يك نوك سمپلر جهت ریختن هموليزات بداخل ستون و لوله توتال استفاده شود .

اسلاید 10: 12- به محض جذب شدن هموليزات برروی رزين بايدبلافاصله بافر اضافه شود 13- اگر قبل از جذب كامل هموليزات برروی رزين، محلول بافر ريخته شود باعث كاهش كاذب هموگلوبين A2 مي گردد. 14- بايد دقت شود تمامي بافر اضافه شده از ستون خارج شود. 15- قبل از خواندن جذب نوري ، بايد لوله A2 و توتال كاملا مخلوط شوند.

اسلاید 11: 16- بايد از يك اسپكتروفتومتر كاليبره جهت خواندن جذب نوري لوله ها استفاده شود. 17- بهتر است از نمونه كنترل صحت تجاري در هر سری كاري استفاده شود در صورت عدم دسترسي، يك نمونه که هموگلوبين A2 آن مشخص شده است به عنوان نمونه كنترل گذاشته شود.

اسلاید 12: - این متد برای اندازه گیری هموگلوبین A2 اختصاصی نیست بطوری که بسیاری از هموگلوبین های همبار با هموگلوبین A2نیز از ستون خارج می شوندکه شامل هموگلوبین C,E,O arab و بعضی از واریانت های هموگلوبین A2 (A2)و زنجیره دلتا میباشند. لذا هموگلوبین A2از این هموگلوبین ها قابل تفکیک نیست.- در مواردی که هموگلوبین A2 بیشتر از 7% می باشد باید به وجود هموگلوبین های C,E,O arab شک نمودکه همراه با هموگلوبین A2از ستون خارج می شوند.در این مورد نیاز به بررسی تکمیلی نظیر الکتروفورز هموگلوبین در PH=8.4و PH=6-6.2 و بررسی فامیلی می باشد.- اگر همه همولیزات اضافه شده یکباره از ستون پاِیین آید ،باید به وجود سایر هموگلوبینوپاتی ها شک نمود. بیمار هموگلوبین S یا Dو G و یا هموگلوبین E,C دارد.- اندازه گیری هموگلوبین A2به روش کروماتوگرافی ستونی نباید در بیمارانی که اخیرا خون دریافت کرده اند صورت گیرد.

اسلاید 13: دامنه مرجع%تفسیر7<- وجود هموگلوبین A2به تنهائی بسیار نادر است- موارد نادر موتاسیونهای β تالاسمی7-3.8- صفت β تالاسمی- هموگلوبین ناپایدار- صفت هموگلوبین S- آنمی داسی شکل- آنمی مگالوبلاستیک3.7-3.4- فقر اهن بسیار شدیدهمراه با صفت β تالاسمی- همراهی واریانت های زنجیره دلتا( ς ) با صفت β تالاسمی - ثاثیر متقابل تالاسمیα و β- موتاسیونهای نادر β تالاسمی- حضور هموگلوبین S (در این مورد صحت اندازه گیری هموگلوبین A2مشکل می شود ) - ثاثیر متقابل تالاسمیα و هموگلوبین S- خطاهای آنالیتیکال(آزمایش باید تکرار شود)3.3-2- فرد طبیعی- دلتا بتا ( ς β)تالاسمی(اگر هموگلوبین F بالا باشد)- موارد نادر صفت β تالاسمی(شامل همراه شدن β با دلتا تالاسمی و α و β تالاسمی)صفت αتالاسمی 2>- دلتا بتا ( ς β)تالاسمی(اگر هموگلوبین F بالا باشد) - صفت αتالاسمی - بیماری هموگلوبین H- حضور واریانت های زنجیره دلتا

اسلاید 14: βThal. With Normal HbA2: 1-Heterozygotes with N. A2 βThal. (type1) HbA2 N,Indices N.or ↓(silent βThal. ) 2- βThal +Delta Thal. (Type2) Indices↓. HbA2 N, HbF↑ Double Hetro. For α & βThal. MCV N., MCH ↓or border line,Hb A2 about 3.2 ► DNA Study

اسلاید 15: ٍELECTEROPHORESISElECTEROPHORESISYour Text HereDr. K. Khodaverdian

اسلاید 16: ALKALINE ELE.Principle: Electrophoresis is the movement of charged particles within an electrical fields.At PH 8.4 Hbs are negatively charged anions →Anod * Supporting Media : Cellulose(Acetate cellulose) Gel(agarose polyacrylamide,starch) * Sample: Hemolysate (Hb→20-30g/l) * Equipment: Chamber,Power Supply,Cellulose AcetateMedium,Applicator * Reagents: 1- Buffer: TEB →pH 8.4-9.2

اسلاید 17: 2-Stain: non specific→Panceau S Specific →o-tuluidine,o-dianisidine 3-Destaining →5%acetic acid -Dehydration →Methanol -Clearing

اسلاید 18: ErrorsCloudy or cont. BufferBuffers of improper PH or ionic strengthCont.of sample wells, applicator ,blotter……Cloudy or old hemolysate metHb→5%KCNImproper presoaking&blotting of cellulose stripsDelay in applying SampleImproper placement of sampleLeukocytosis →Anodal than Hb H (leu. Myeloperoxidase)GlycoHb →band Anodal to Hb A

اسلاید 19: +-H,I,J A F Lepore,S,D,G A2,C,E,O CA

اسلاید 20: Anode(+) …….. C C-Harlem......... S ………. O arab .......................Origin D,E,G,Lepore,H,I,N, ............A Barts .............F ( Cathode(-

اسلاید 21: + HAFS,DGA2,C,ECAOriginAnodeCatodeAPH= 8.6 OarabCS,C-harlemoriginA,D,E,G,HF,BartsO-arabAnodeCatodePH=6

اسلاید 22: Cation Exchange Choromatography interchange of charge group on the ion exchange material(negatively stationary charge)with charge group on Hb (positively charge)molecule.Adventages: -Automated -Very small sample are sufficent -Quantification of N.&Var. Hb are available HPLC

اسلاید 23: Disadvantage: -expensive -Co-elute some variants together HPLC Usually separates HbA,A2,F,S,C,D,&G from each other. Hb E&Lepore co-elute with Hb A2.

اسلاید 24:

اسلاید 25:

اسلاید 26: GUIDELINES FOR INTERPRETAION A1a -A1b –F -LA1C/CHb -A1C –P3 - A0 -A2- S –C-Total Area of Each Analysis:1.0-4.0 millvolt/sec-Quality Control Values are in Ranges-Reportable Range: A1c:3.7%-18.4%- A2:1.5%-11.4% - 0.8%-16.5% out of range→(*) A1c out side of reportable range should not reportA2&F →less than 1.5%or less than 1% greater than 11.4% or16.5%

اسلاید 27: Limitation - HbF>16.5%, HbF may elute in LA1c/CHb or A1c window and no Hb F will report. - HbA1c >18.4% should be tested for possible of Hb Variant interference -Hb A2>10 % should be tested for possible presence of Hb Var. Hb D &Hb E are coelute with Hb A2 -Hb E samples may generate carry over in the subsequent injection

اسلاید 28: - A degradation peaks may coelute with the HbA2 peak when samples contains Hb S which have not been stored appropriately review HbA2 peak shape for all Hb S samplesbefore report- A degradation peaks may interfere with the measurement HbA1c when samples contains varients D &E have not been stored appropriately . do not report A1c result if an unKnown peak is identified between A1c& P3Samples with Hb varients should be checked for Hb A2&A1c peak shape.

اسلاید 29: Typical E-Beta thal Sample: high F peak shifted to La1c/Chb window HbA2>10% (HbE)

اسلاید 30: Sickledex is POSITIVE; Peripheral smear with 2+ sickle cellsHbF: 1.0%; HbA: 38.7%; HbA2: 4.4%; HbS: 56.1%

اسلاید 31: Solubility testSickling Hb, in deoxygenated state (dithionite Na2S2O4) is insoluble & forms a precipitate at high molarity Phosphate bufferTest not specific for Hb S,Report :Pos or Neg . Pos test did not distinguish Hb AS,SS, S/β+ ….Sample: whole blood →packed cellControl: Pos. Control About 30-45% Hb S,

اسلاید 32: Source of errorInactive or out date reagentFalse negative result: Anemia,infant<6 months, resent transfusionImproper Tem.of ReagentsImproper mixing of the specimen with ReagentImproper interpretation of the reader scaleFalse Posative result:persons with paraproteinemia,hyperlipidemia, leukcocytosis Unstable Hb (after spleenectomy ,Heinz body

اسلاید 33:

اسلاید 34: Sickle cell anemia:In sickle cell trait, usually see HbS concentrations of 35 to 45% of total Hemoglobin because the HbS has a slower rate of synthesis than HbAIf HbS is less than 33%, start thinking about S-alpha-thalassemiaIf HbS is greater than 50%, worry about S-Beta-thalassemia or Sickle cell disease with transfusion

اسلاید 35: Expected ratios

اسلاید 36: Hb Falkalane denaturation (bethke) Hb F 2-40%Column chromatograpy HbF >40%Immunological methods H b <2%Hb→ HICN →NaoH →Hb denaturation →Amonium sulfate (stop solution ,↓PH precipitates the denature Hb) filtered→ Hb F measured at 540 nm

اسلاید 37: Difference of duplicate: 0.5%→ HbF 0-5% 1% → HbF 5-15% 2% → HbF >15% Final concenteration of NaoH & Amonium sulfate solution are critical