اهمیت سرطان

اهمیت سرطان

اسلاید 1: QC tumor markers Dr .mehrdad vanaki Consultant of quality assurance & QMS in med labs

اسلاید 2: اهمیت سرطان25درصد مرگ و میر ها در امریکا ناشی از کانسر است سیر مرگ و میر ناشی از کانسر هوچکین ورحم و دهانه رحم و معده به طور چشمگیر کاهش یافته ولی در عوض سیر مرگ و میر ناشی از کانسر لنفوم غیر هوچکین و کانسر ریه و ملانوم و مولتیپل میلوما به میزان 15 درصد رشد داشته است تشخیص زود رس و درمان موثرتر همراه با پیشگیری به میزان قابل توجهی مرگ و میر ناشی از کانسر را کاهش می دهد تعریف ساده کانسر: رشد نسبتا خود مختار بافت کارسینوژن: عاملی که باعث رشد سرطان می گردد که فیزیکی (اشعه ایکس) یا شیمیایی ( پلی سیکلیک هیدروکربن- بنزن) یا بیولوژیک ( نوعی ویروس) می باشد و از طریق تغییرات در ژنوم یا افزایش تکثیر منجر به بروز سرطان می گردد

اسلاید 3: TUMOR MARKERSWhat are they?Are substances usually proteins, that are produced by the body in response to cancer growth or by the cancer tissue itself and certain benign (noncancerous) conditionsDetected in higher than normal amounts in the blood, urine, or body tissuesSome tumor markers are specific for one type of cancer, while others are seen in several cancer typesMeasurements can be useful – when used along with x-rays, or other tests in the detection and diagnosis of some types of cancer

اسلاید 4: TUMOR MARKERSMeasurements of tumor marker levels alone are not sufficient to diagnose cancer for the following reasons:Tumor marker levels can be elevated in people with benign conditionsTumor marker levels are not elevated in every person with cancer – especially in early stages of the diseaseMany tumor markers are not specific to a particular type of cancer سنجش تومور مارکر ها به تنهائی در تشخیص کانسر به دلایل ذیل کافی نمی باشد :1- سطح تومور مارکر در واکنش های التهابی و خوش خیم نیز افزایش می یابد 2- سطح بسیاری از تومور مارکر ها در مراحل ابتدائی و اولیه کانسر افزایش نمی یابد 3- تعداد زیادی از تومور مارکر فاقد اختصاصیت یا ویژگی کافی برای یک نوع کانسر خاص می باشند

اسلاید 5: A good tumor maker should have those properties:1. A tumor marker should be present in or produced by tumor itself.2. A tumor marker should not be present in healthy tissues. 3. Plasma level of a tumor marker should be at a minimum level in healthy subjects and in benign conditions.ویژگی های یک تومور مارکر خوب در آزمایشگاه بالینی1- یک تومور مارکر خوب بایستی از منبع خود تومور ترشح و تولید گردد 2- یک تومور مارکر خوب نبایستی از اعضای سالم بدن ترشح شود 3- سطح غلظت پلاسمایی یک تومور مارکر خوب بایستی در وضعیت سلامت و شرایط التهابی خوش خیم در حداقل میزان خود باشد

اسلاید 6: 4. A tumor marker should be specific for a tissue, it should have different immunological properties when it is synthesized in other tissues.5. Plasma level of the tumor marker should be in proportion to the both size of tumor and activity of tumor.6. Half life of a tumor should not be very long4-یک تومور مارکر خوب بایستی برای یک بافت اختصاصی باشد و به راحتی به روش های ایمونولوژیک قابل شناسایی و تمایزاز سایر بافت ها باشد5- سطح غلظت پلاسمایی یک تومور مارکر خوب بایستی توانایی تمایز میزان فعالیت و سایز تومور را داشته باشد 6- نیمه عمر یک تومور مارکر خوب نبایستی خیلی طولانی باشد

اسلاید 7: 7. A tumor marker should be present in plasma at a detectable level, eventhough tumor size is very small 7- یک تومور مارکر خوب بایستی در شرایطی سایز یک تومور بسیار کوچک و در مراحل اولیه باشد در یک سطح غلظت قابل شناسایی در پلاسما قابل شناسایی باشد

اسلاید 8: Potential uses of tumor markersScreening in general populationDifferential diagnosis of symptomatic patientsClinical staging of cancerEstimating tumor volumeAs a prognostic indicator for disease progressionEvaluating the success of treatmentکاربرد های بالقوه تومور مارکر ها1-غربالگری جامعه2-تشخیص افتراقی بیماران علامت دار 3- تعیین استیج کانسر 4-تخمین سایز و حجم کانسر 5-اندیکاتور تعیین پروگنوز و مراحل پیشرفت بیماری و تومور6-ارزیابی موفقیت درمان

اسلاید 9: Detecting the recurrence of cancerMonitoring reponse to therapyRadioimmunolocalization of tumor masses شناسایی عود کانسرمانیتورینگ و کنترل روند پاسخ به درمان تعیین رادیوایمونولوژیک موضع توده های تومور

اسلاید 10: In order to use a tumor marker for screening in the presence of cancer in asymptomatic individuals in general population, the marker should be produced by tumor cells and not be present in healthy people. However, most tumor markers are present in normal, benign and cancer tissues and are not spesific enough to be used for screening cancer.به جهت کاربرد یک تومور مارکر با هدف غربالگری خصوصا در افراد بدون علامت و عموم جامعه الزاما این مارکر نبایستی در افراد سالم حضور داشته باشد و بایستی صرفا ازسلو های تومورال بایستی ترشح گردد.در هر حال واقعیت فعلی این است که اکثر تومور مارکر های فعلی در شرایط نرمال در افراد سالم حضور دارند خصوصا در شرایط بافت های خوش خیم لذا از ویژگی کافی جهت کاربرد به عنوان یک تست غربالگری برخوردار نمی باشند

اسلاید 11: Few markers are specific for a single individual tumor, most are found with different tumors of the same tissue type. They are present in higher quantities in blood from cancer patients than in blood from both healthy subjects and patients with benign diseases. ندرتا برخی از مارکر ها برای یک تومور منفرد اختصاصی بوده ولی غالب تومور مارکر ها در تومور های مختلف به طور اشتراکی یافت می شوند و وفاقد ویژگی برای یک نوع تومور می باشند

اسلاید 12: Some tumor markers have a plasma level in proportion to the size of tumor while some tumor markers have a plasma level in proportion to the activity of tumor.The clinical staging of cancer is aidded by quantitiation of the marker.

اسلاید 13: Serum level of marker reflects tumor burden. The level of the marker at the time of diagnosis may be used as a prognostic indicator for disease progression and patient survival. After successful initial treatment, such as surgery, the marker value should decrease. The rate of the decrease can be predicted by using the half life of the marker.

اسلاید 14: The magnitude of marker reduction may reflect the degree of success of the treatment. In the case of recurrence of cancer, marker increases again.Most tumor marker values correlate with the effectiveness of treatment.

اسلاید 15: An ideal tumor markerThe quality should be included High sensitivity High specificityCan be qualified Safe ConvenienceLow price

اسلاید 16: How to identify tumor marker ? On cellCytochemistry, Flow cytometryOn tissueHistochemistry, Cytosol assays In body fluidsBlood, urine, CSF, Amniotic fluid

اسلاید 17: Assay technologyMonoclonal antibody (MoAb) Specificitymass productionSandwich techniqueMoAbs1 + Tumor marker MoAbs2 + Tracer

اسلاید 18: Sandwich TechniquesTumor markers as a antigen between two MoAbs The first is bound onto a solid support (tubes or wells…)The second, unbound upon introduction into the assay carries the signal (tracer: radionuclide, enzyme, fluorochrome…)

اسلاید 19: Sandwich techniques

اسلاید 20: Tumor marker in OncologyScreening DiagnosisStagingPrognosis

اسلاید 21: ScreeningTumor markers play a limited role for tumor screening, just because….relatively low sensitivitylack of specificity and relation to tumor sizeInappropriate for the detection of small in situ cancerIn some cases, tumor markers can be equal to other examinations envisioned for screeningPSA & prostate cancercalcitonin & medullary thyroid cancer

اسلاید 22: DiagnosisTumor is not the key diagnostic examination, but can be a complementary sign to clinical finding or medical imagingAFP & hepatomaSometimes implicate the existence within the tumor of an exclusive secretary histological contingentNSE & SCLC

اسلاید 23: StagingThe tumor markers and medical imaging are complementary in the pre-therapeutic and post-therapeutic staging

اسلاید 24: PrognosisThe pre-therapeutic level of certain tumor marker can contributes a prognostic factor because of links with... Metabolic activityTumor sizeInvasionMore valuable in that it is independent or other usual prognostic factors for the pathology

اسلاید 25: Allow doctors to refine therapeutic strategy by selecting groups with risk of failure response to treatment This property is one of the major aspects of current use of the tumor marker CEA & colon cancerCA19-9 & pancreatic cancerCYFRA 21-1 & lung squamous cell cancer

اسلاید 26: During treatmentHigh markers level before treatment generally Not only correlate very well with the therapeutic result but are sometimes superior to this result in the assessment of complete remissionThe assay must be taking into account the marker half-life when during treatment and all post-therapeutic re-evaluation

اسلاید 27: During monitoringContribute to a valuable mean and lead to suspicion for...local or metastasiscurable recurrencemuch earlier before clinical or radiological detectionThe protocol of the follow-up must be very strictCA15-3 measured every 3 months for 1 year and then every 6 months in breast cancer patient

اسلاید 28: Diagnosis or monitoringMeasuring patients’ levels of AFP, CA 19-9, CEA, Free PSA, and Total PSA are clinically useful in the monitoring of cancers

اسلاید 29: ClassificationCarcino-embryonic proteinAFPCEACarcino- associated proteinB2MPSATGTPACarbohydrate antigenCA125CA19-9CA15-3SCCHormoneCTACTH BHCG

اسلاید 30: Tumor marker carcino- associated - proteins

اسلاید 31: Prostate Specific Antigen (PSA)The clinical use of PAP has been replaced by PSA. PSA is much more specific for screening or for detection early cancer. It is found in mainly prostatic tissue. PSA exists in two major forms in blood circulation. The majority of PSA is complexed with some proteins. A minor component of PSA is free.

اسلاید 32: PSA tumor markerسرطان پروستات رتبه اول در مردان را دارا است و تشخیص زود هنگام اهمیت ویژه ای دارد PSA ان با تومور مارکربا اسکرین و تشخیص اولیه کانسر پروستات با یک درمان رادیکال پروستاتکتومی می توان به یک درمان نسبتا قطعی رسید و امید به زندگی در این کانسر حدود 10 سال می باشد .

اسلاید 33: PSA, continued…Regulation and Physiology:There are 2 major forms of PSA that are found circulating in the blood:Free Complexed:Complexed to 1-antichymotrypsin or 2-macroglobulin.The detection of total PSA has been used in screening for and in monitoring of prostate cancerThe measurement of free PSA can help to differentiate levels of PSA that are in the grey zone: i.e. not high enough to diagnose cancer prostate, but not low enough to rule out the diagnosis of cancer prostate: Patient with cancer prostate have a lower % of free PSA.

اسلاید 34: PSA testing itself is not effective in detecting early prostate cancer. Other prostatic diseases, urinary bladder cateterization and digital rectal examination may lead an increased PSA level in serum. The ratio between free and total PSA is an reliable marker for differentiation of prostatic cancer from benign prostatic hyperplasia.

اسلاید 35: The use of PSA should be together with digital rectal examination and followed by transrectal ultrasonography for an accurate diagnosis of cancer.Serum level of PSA was found to be correlated with clinical stage, grade and metastasis

اسلاید 36: The greatest clinical use of PSA is in the monitoring of treatment. This treatment includes radical prostatectomy, radiation therapy and antiandrogen therapy. The PSA level should fall below the detection limit. This may require 2-3 weeks. If it is still at a high level after 2-3 weeks, it must me assumed that residual tumor is present.

اسلاید 37: نیمه عمر آنتی ژن اختصاصی پروستات PSA افزایش فیزیولوژیک و کاذبنیمه عمرنسبتا بالا آنتی ژن اختصاصی پروستات ( حدود 20 الی 30 ساعت) منجر به افزایش فیزیولوژیک و کاذب این مارکر پس از اعمال تهاجمی نظیر توشه رکتال و معاینه پروستات و عمل جراحی پروستاتکتومی یا سونوگرافی یا بیوپسی از طریق رکتوم می گردد لذا به مدت 3 هفته زمان نیاز است تا سطح افزایش یافته آنتی ژن اختصاصی پروستات به سطح واقعی خود بازگردد احتباس ادراری حاد نیز منجر به افزایش کاذب این تومور مارکر می گرددمعاینه انگشتی پروستات از طریق رکتوم در برخی افراد تا دو برابر افزایش کاذب حاصل می نماید و در گروهی افراد هیچ تغییری حاصل نمی نماید.

اسلاید 38: PSAکاربرد بالینی در غربالگری کانسر پروستاتآنتی ژن اختصاصی پروستات علاوه برغربالگری کانسر پروستات در مرحله بندی( استیجینگ) و پایش درمان و عود سرطان کاربرد جدی دارد تشخیص زود رس کانسر پروستات : با توجه به اینکه بزرگی خوش خیم پروستات و کانسر پروستات از مشکلات شایع در مردان بالای 50 سال می باشد اسکرین سالانه یک بار به طور جدی توصیه می گردد. محدوده 4 الی 10 این مارکر تا حدود زیادی به نفع بزرگی خوش خیم پروستات می باشد ولی نفی کننده کانسر نمی باشد ( خصوصا در مراحل ابتدایی) لذا آزمایشات تکمیلی نظیر اندازه گیری سطح آزاد و توتال و نسبت مربوطه به همراه بیوپسی و اقدامات بالینی و تصویر برداری تکمیل کننده حلقه تشخیص نهایی می باشد

اسلاید 39: رفرانس رنج انتی ژن اختصاصی پروستات برای بهبود توانایی آنتی ژن اختصاصی پروستات یک رویکرد اصلاح رفرانس رنج( با واحد میکروگرم در لیتر) مطابق سن می باشد بر اساس رفرانس تیتز 200849-40 سال : 0-2.559-50 سال : 0-.3.5 69-60 سال : 0-.4.579-70 سال : 0-.6.5در این رویکرد با پایین اوردن حد فوقانی رفرانس رنج در افراد جوانتر تعداد کانسر پروستات بیشتری در سنین میانسالی کشف و درمان قطعی می گردد .

اسلاید 40: PSAمارکر تراکم تقسیم غلظت تومور مارکر پروستات بر حجم پروستات اندازه گیری شده با سونو رکتال کاربرد در بیمارانی است که سطح غلظت 4 الی 10 ( محدوده خاکستری تشخیص کانسر ) دارنداگر در این گروه افراد معاینه فیزیکی رکتال برای پزرگی پروستات منفی باشد و و مارکر تراکم پروستات بالا باشد مجموعا به نفع کانسر اولیه پروستات می باشد و پیگیری مداوم سطح غلظت آنتی ژن پروستات و بیوپسی ضرورت دارد.افزایش جهشی ( متناسب با زمان ) آنتی ژن اختصاصی پروستات نیز مارکر تشخیصی مناسبی برای کانسر اولیه می باشد

اسلاید 41: NAF- PSA آنتی ژن اختصاصی پروستات مترشحه از مایع نوک پستان مهمترین آنتی ژن اختصاصی پروستات با منشا غیر پروستاتی این مارکربه عنوان یک ریسک فاکتور در ترشحات پستان زنان مبتلا به کانسر پستان بالاتر از زنان نرمال می باشد این تومور مارکر در پستان با مثبت بودن گیرنده استروژن و پروژسترون رابطه دارد و به طور قابل توجهی با مقاوت به درمان کانسر پستان ( تاموکسیفن) رابطه داردبا منشاغیر پروستاتیPSAعمدتا در بافت های تنظیم کننده هورمونی میباشند که می تواند با اندروژن و پروژستین ها و گلوکورتیکویید ها فعال گردد

اسلاید 42: PSAکاربرد بالینی در مرحله بندی( استیجینگ) کانسر پروستاتبالا بودن غلظت مارکر و روند افزایش مکرر ماکر نشانه پیشرفته بودن بیماری کانسر پروستات می باشد ولی برای استیجینگ مارکر آنتی ژن اختصاصی پروستات نمی تواند کمک کننده باشد و نیاز به تست های تکمیلی بیوپسی و تصویر برداری می باشدآنتی ژن اختصاصی پروستات در کانسر غیر متاستاتیک محدود به پروستات حداکثر تا عدد 50 بالا می رود و ندرتا بالای این عدد مشاهده می گردد لذا اعداد بالای 50 در تشخیص متاستاز کانسر پروستات کمک کننده می باشد ( ولی نه با قطعیت) و یا اعداد کمتر از 20 کمتر با متاستاز استخوانی همراه می باشند .این موضوع اهمیت گزاش دهی و خطی بودن و صحه گذاری اعداد بسیار بالای این مارکردر آزمایشگاه ها را نشان می دهد .

اسلاید 43: PSAکاربرد بالینی در پایش درمان کانسر پروستاتدر پروستاتکتومی رادیکال تمام بافت پروستات برداشت می گردد لذا سطح انتی ژن اختصاصی پروستات بایستی غیر قابل تشخیص و زیر حد تشخیصی کیت باشد . برای این اندازه گیری به دلیل نیمه عمر بالای این مارکر حداقا 2 الی 3 هفته برای یک اندازه گیری سرمی بایستی فاصله بدهیم و سپس موفقیت درمان را از طریق این مارکر ارزیابی و پایش نماییم و ترجیحا آزمایشگاه جهت پایش درمان کانسر پروستات از کیت های سنجش فوق حساس ( 0.01 الی 0.001) آنتی ژن اختصاصی پروستات با سطح حساسیت بسیار بالا استفاده نماید تا بتوان نوسانات جزیی و حداقل را نیزشناسایی و رد یابی نمود . پس از رادیکال پروستاتکتومی 80 درصد مارکر به زیر 0.01 می رسد و 20 درصد موارد به زیر 0.001 می رسد که با روش های رایج روتین غیر قابل سنجش می باشد و در زمان عود بیماری با روش های رایج تا زمانی که غلظت به بالای 0.1 نرسد متوجه تغییرات در بیمار نمی شویم .کیت های فوق حساس جهت اندازه گیری سطح آنتی ژن اختصاصی پروستات در خانم ها نیز کاربرد دارد چرا که به طور طبیعی غلظت این مارکر در زنان کمتر از 0.01 می باشد . این مارکر در زنان در طول بارداری و کانسر پستان افزایش می یابد .

اسلاید 44: PSAکاربرد بالینی در پایش درمان کانسر پروستاتبالا بودن این مارکر سه هفته پس از رادیکال پروستاتکتومی نشانه این است که بقایای غده پروستات بدرستی تخلیه نگردیده است مارکر انتی ژن اختصاصی پروستات تا یک سال پس از جراحی هر سه ماه یکبار و در سال دوم هر چهار ماه یکبار و در سال دوم به بعد هر شش ماه یکبار بایستی چک شود به صلاح پزشک و بیمار می باشد که برای مانیتور دقیق این مارکر بهتر است در یک مرکز آزمایشگاهی معتبر با یک متد معتبر در طول زمان چک شود تا شامل نوسانات بین آزمایشگاهی و متد ها نگردد.

اسلاید 45: PSAکاربرد بالینی در اشعه (پرتو) درمانی کانسر پروستاتقاعدتا پس از اشعه درمانی انتظار کاهش تدریجی مارکر را داریم ولی نقش و کاربرد ان به اندازه پایش درمان پس از رادیکال پروستاتکتومی نمی باشد

اسلاید 46: tumor marker HORMONESCalcitoninCalcitonin is a hormone which decreases blood calcium concentration in response to hypercalcimiaIts elevated level is usually associated with medullary thyroid cancer.Calcitonin levels appear to correlate with tumor volume and metastasis. Calcitonin is also useful for monitoring treatment and detecting the recurrence of cancer.

اسلاید 47: However calcitonin levels are also at a high levels in some patients with cancer of lung, breast, kidney, liver and in nonmalignant conditions such as pulmonary diseases, pancreatitis, Paget’s disease, hyperparathyroidism, myeloproliferative disordes and pregnancy.

اسلاید 48: BHCG tumor markerافزایش تیتر گنادوتروپین جفتی در بارداری و بیماری های تروفوبلاستیک ( مول و کوریوکارسینوما و..) و تومور های جرم سل ( سلول زایا) بیضه دیده می شود و یک شاخص تومور مارکر مفید برای تومور های تروفوبلاستیک و تومور های بیضه می باشد گنادوتروپین جفتی یک هورمون گلیگوپروتینی است که از سلول سن سیتوتروفوبلاستیک جفت ترشح می گردد و دارای دو زنجیره الفا ( مشترک با با سایر هورمون های هیپوفیز قدامی ) و زنجیره اختصاصی بتا می باشد رفرانس رنج در آقا و خانم کمتر از 5 واحد بین المللی در لیتر استدر اوایل حاملگی زیرواحد بتا آزاد همراه با ملکول کامل تولید می شود و در اواخر بارداری زیر واحد آلفا آزاد غلبه می یابد و در کانسر های تروفوبلاستیک و سلول زایا زیر واحد بتا آزاد و ملکول کامل تولید می گردد.

اسلاید 49: BHCG tumor marker کاربرد بالینیهورمون گنادوتروپین توتال در100 درصد بیماران تومور های تروفوبلاستیک دارای مقادیر بسیار بالا در حد بالای 1000000 واحد در لیتر خواهد بود و در 70 درصد تومور های جرم سل غیر سمینوم بیضه مردان ( با فراوانی کمتر در تومور سمینوم بیضه) نیز افزایش قابل ملاحظه می یابد( خصوصا با کاربرد مشترک با هورمون الفا فتو پروتین) بیشترین فایده و کاربرد گنادوتروپین جفتی در پایش درمان و بررسی روند پیشرفت تومور های تروفوبلاستیک می باشد .چرا که غلظت آن با حجم و سایز تومور متناسب است . بیماری که سطح اولیه و قبل از درمان گنادو تروپین جفتی او بالای 400000 است احتمال خطر شکست درمان بالاتر است پس از جراحی تومور های تروفوبلاستیک با نیمه عمر 12 الی 20 ساعته هورمون انتظار می رود گنادو تروپین در هفته های اول افت محسوس نماید و پایداری غلظت هورمون نشانه بافی ماندن بقایای جفتی تومور می باشد . در طول شیمی درمانی اندازه گیری هفتگی گنادوتروپین توصیه می گردد و پس از بهبودی کامل سالانه یکبار توصیه می گردد .

اسلاید 50: BHCG tumor marker assay methodHCG total methodدراین روش ایمونومتریک واحد های آزاد بتا و آلفا اندازه گیری نمی شود و صرفا واحد های کامل ملکول توسط دو آنتی بادی ضد آلفا و بتا سنجیده می شود BHCG method در این روش ملکول های کامل و دست نخورده بعلاوه زنجیره های آزاد بتا اندازه گیری می شوند و نوع آنتی بادی از نوع منوکلونال بر علیه بتا ساب یونیت می باشد این روش به عنوان ارزیابی تومور مارکر ارجحیت دارد و دلیل واضح ان افزایش ترشح زنجیره بتا آزاد در تومور های تروفوبلاستیک می باشد

اسلاید 51: CARBOHYDRATE MARKERSThese markers either are antigens on the tumor cell surface or are secreted by tumor cells. They are high-molecular weight mucins or blood group antigens. Monoclonal antibodies have been developed against these antigens. Most reliable markers in this group are CA 15-3, CA 125 and CA19-9.تومور مارکر های کربوهیدراتی( عمدتا موسین با وزن ملکولی بالا) عمدتا آنتی ژن هایی هستند که بر روی سطح سلول های تومورال دیده می شوند و با توجه به اینکه از خود سلول تومورال ترشح می شوند نسبت به تومور مارکر های پروتئینی و هورمون ها اختصاصی تر جهت تومور ها می باشند

اسلاید 52: CA 15-3CA 15-3 is a marker for breast carcinoma. Elevated CA 15-3 levels are also found in patients with pancreatic, lung, ovarian, colorectal and liver cancer and in some benign breast and liver diseases. It is not useful for diagnosis. It is most useful for monitoring therapy. این تومور مارکر مفید ترین شاخص برای کانسر پستان هست که قطعا برای تشخیص اولیه مفید نبوده( به دو دلیل 1- غیر اختصاصی بودن تومور مارکر و مثبت شدن این تومور مارکر در بسیاری از واکنش های خوش خیم و التهابی کیست و تومور های خوش خیم تخمدان – ضایعات التهابی و فیبروکیستیک خوش خیم پستان – هپاتیت مزمن – سیروز کبدی – هیپو تیروئیدی و..2- افزایش بسیار جزئی تومور مارکر در مراحل تشخیص اولیه کانسر پستان ) و بیشترین کاربرد بالینی آن در مانیتورینگ درمان کانسر پستان می باشد.

اسلاید 53: CA 15-3افزایش متناقض این تومور مارکر در شروع درمان کانسر پستان نشانه پاسخ به درمان و لیز تومور و آزاد سازی این مارکر با غلظت بالا می باشدافزایش 25% تومور مارکر در بیمار مبتلا به کانسر سینه در حال درمان نشانه خوبی بر عود کانسر ( خصوصا در بافت احشایی و استخوانی ) می باشد CA 27-29در استیج دوم و سوم کانسر پستان کاربرد دارد و به لحاظ بالینی هم ارزش تومور مارکرپانزده – سه می باشدCA 549از تومور مارکر های مفید در کانسر پستان در فاز درمان

اسلاید 54: CA 125 Although CA 125 is a marker for ovarian and endometrial carcinomas, it is not specific. CA 125 elevates in pancreatic, lung, breast, colorectal and gastrointestinal cancer, and in benign conditions such as cirrhosis, hepatitis, endometriosis, pericarditis and early pregnancy. It is useful in detecting residual disease in cancer patients following initial therapy.

اسلاید 55: CA 19-9CA 19-9 is a marker for both colorectal and pancreatic carcinoma.However elevated levels were seen in patients with hepatobiliary, gastric, hepatocellular and breast cancer and in benign conditions such as pancreatitis and benign gastrointestinal diseases. CA 19-9 levels correlate with pancreatic cancer staging. It is useful in monitoring pancreatic and colorectal cancer.

اسلاید 56: PROTEIN MARKERSMost reliable markers in this group are β2-microglobulin, ferritin, thyroglobulin immunoglobulin. β2-microglobulin β2-microglobulin is a marker for multiple myeloma, Hodgkin lymphoma. It also increases in chronic inflammation and viral hepatitis.

اسلاید 57: FerritinFerritin is a marker for Hodgkin lymphoma, leukemia, liver, lung and breast cancer.ThyroglobulinIt is a useful marker for detection of differentiated thyroid cancer.

اسلاید 58: Immunoglobulin: Monoclonal immunoglobulin has been used as marker for multiple myeloma for more than 100 years. Monoclonal paraproteins appear as sharp bands in the globulin area of the serum protein electrophoresis. Bence-Jones protein is a free monoclonal immunoglobulin light chain in the urine and it is a reliable marker for multiple myeloma.

اسلاید 59: Monoclonal gammopathyAlbumin12Albumin decreasedSharp peak in gamma region

اسلاید 60: GENETIC CHANGESFour classes of genes are implicated in development of cancer: 1) protooncogenes which are responsible for normal cell growth and differentiation2) tumor suppressor genes which are involved in recognition and repair of damaged DNA. 3)apoptosis-related genes are responsible for regulation of apoptosis4)DNA repair genesAlterations on these genes may lead tumor development.

اسلاید 61: Susceptible protooncogenes:K-ras, N-ras mutations are found to be correlated acute myeloid leukemia, neuroblastoma

اسلاید 62: Her-2/neuIt is a proto-oncogene that upon:Mutation (especially point mutation) or Altered (over) expression will encode an Epidermal Factor Receptor (EGF-R) that mediate tumorigenesis (i.e. It is an activation mutation)Marker for breast and ovarian cancersApplication: It is now routinely measured in breast cancer to determine the type of therapy:Breast cancer positive for Her-2/neu is responsive to treatment (Herceptin)Breast cancer negative for Her-2/neu is NOT responsive to treatment

اسلاید 63: Susceptible DNA repair genes:BRCA1 and BRCA2 are specific genes in inherited predisposition for developing breast and over cancer, and mutations on these genes are newly measured in some laboratories. Mismatch-repair genes are mutated in some colon cancers

اسلاید 64: Chromosomal translocationc-myc gene has been found to be translocated from 8.chromosom to 14. chromosom and than become activated in Burkitt’s lymphoma.myc gene encodes a DNA-binding protein which stimulates cell dividing.

اسلاید 65: In chronic myeloid leukemia, there is a translocation between chromosomes 9 and 22.

اسلاید 66: quality requirements relevant to all tumor marker measurementsPre-analytical requirements : choice of tumor marker, specimen type, specimen timing, sample handling. Analytical requirements : assay standardisation, internal and external quality control, interferences. Post-analytical requirements : reference intervals, interpretation and reporting of tumor marker results

اسلاید 67: Pre-analytical quality requirements Reporting of erroneous tumor marker results is more likely to cause undue alarm to patients than is the case for many other laboratory tests. The laboratory must therefore exercise extra vigilance in ensuring that correct results are reported. Errors in the pre-analytical phase reportedly occur ten times as often as in the analytical phasethe majority of pre-analytical errors for tumor markers will be simple specimen handling errors – e.g. inappropriate sampling handling, hemolyzed specimens, insufficient specimens, and incorrect specimens – and their occurrence should be minimized by adherence to good laboratory practice and assessment in an effective audit cycle.

اسلاید 68: Quality requirements in the pre-analytical phase

اسلاید 69: Quality requirements in the pre-analytical phase

اسلاید 70: Analytical quality requirements The almost universal use of automated immunoassay analysers for many commonly requested tests means that responsibility for analytical quality now rests largely with the diagnostic industry, which must meet quality requirements defined by national or international regulatory authorities [e.g. US Food and Drug Administration (FDA) regulations, European Commission In Vitro Diagnostics Directive (IVDD)].It is nevertheless crucial for satisfactory measurement of any analyte that laboratories independently monitor their own performance carefully, both to ensure that analyzers are being used appropriately and to confirm that individual methods are performing according to specification. This is best achieved by implementation of rigorous Internal Quality Control (IQC) and participation in well-designed Proficiency Testing [External Quality Assessment (EQA)] programs (1).

اسلاید 71: Analytical quality requirements Long-term monitoring presents major challenges as patients may change hospital and laboratories may change the tumor marker methods during the relevant time period. While ideally results obtained in different methods would be fully interchangeable, data from PT schemes confirm that this is not the case, with between-method coefficients of variation in excess of 20% still observed for some tumor markers .Major causes of observed between-method variation for these complex analytes include poor calibration, differences in the specificity of antibodies used, and differences in method design.It should be possible to achieve reasonably standardized and accurate calibration, but only for those analytes for which a recognized International Standard (IS) or Reference Reagent (IRR) is both available and universally adopted by diagnostic manufacturers for primary calibration of their methods. Unfortunately, as yet there are no IS for any of the important CA series of tumor markers, a major gap that should be addressed urgently. Long-term PT scheme data can also confirm the effect of successful introduction of a new IS. Data from the UK National External Quality Assessment Scheme (UK NEQAS) for PSA, for example, confirm that mean geometric coefficients of variation (which reflect scatter) decreased from 21.9% in 1995, before the 1st IRR was introduced, to 9.5% in 2004

اسلاید 72: NACB recommendations: Quality requirements for Assay Validation, Internal Quality Control and Proficiency Testing

اسلاید 73: NACB recommendations: Quality requirements for Assay Validation, Internal Quality Control and Proficiency Testing

اسلاید 74: NACB recommendations: Quality requirements for Assay Validation, Internal Quality Control and Proficiency Testing

اسلاید 75: NACB recommendations: Quality requirements for Assay Validation, Internal Quality Control and Proficiency Testing

اسلاید 76: NACB recommendations: Quality requirements for Assay Validation, Internal Quality Control and Proficiency Testing

اسلاید 77: NACB recommendations: Quality requirements for Assay Validation, Internal Quality Control and Proficiency Testing

اسلاید 78: NACB recommendations: Quality requirements for Assay Validation, Internal Quality Control and Proficiency Testing

اسلاید 79: NACB recommendations: Quality requirements for Assay Validation, Internal Quality Control and Proficiency Testing

اسلاید 80: NACB recommendations: Quality Requirements for minimizing risk of method-related errors in tumor marker results

اسلاید 81: NACB recommendations: Quality Requirements for minimizing risk of method-related errors in tumor marker results

اسلاید 82: NACB recommendations: Quality requirements in the post-analytical phase

اسلاید 83: NACB recommendations: Quality requirements in the post-analytical phase

اسلاید 84: NACB recommendations: Quality requirements in the post-analytical phase

اسلاید 85: NACB recommendations: Quality requirements in the post-analytical phase

اسلاید 86: NACB recommendations: Quality requirements in the post-analytical phase

اسلاید 87: REFERENCES 1. Fleisher M, Dnistrian AM, Sturgeon CM, Lamerz R, Wittliff JL. Practice guidelines and recommendations for use of tumor markers in the clinic. Chapter 5 in: Tumor Markers: Physiology, Pathobiology, Technology, and Clinical Applications, eds Diamandis EP, Fritsche HA, Lilja H, Chan DW, Schwartz MK. AACC Press, Washington DC 2002 pp 33-64 2. Hayes DF, Bast R, Desch CE, et al. A tumor marker utility grading system (TMUGS): a framework to evaluate clinical utility of tumor markers. J. Natl Cancer Inst. 1996; 88: 1456-1466. 3. Sturgeon CM. Limitations of assay techniques for tumor markers. Chapter 6 in: Tumor Markers: Physiology, Pathobiology, Technology, and Clinical Applications, eds Diamandis EP, Fritsche HA, Lilja H, Chan DW, Schwartz MK. AACC Press, Washington DC 2002 pp 65-81. 4. Hammond EH. Quality control and standardization for tumor markers. Chapter 4 in Chapter 6 in: Tumor Markers: Physiology, Pathobiology, Technology, and Clinical Applications, eds Diamandis EP, Fritsche HA, Lilja H, Chan DW, Schwartz MK. AACC Press, Washington DC 2002 pp 25-32. 5. Price CP, Allard J, Davies G, Dawnay A, Duffy MJ, France M, et al. Pre-and post-analytical factors that may influence use of serum prostate specific antigen and its isoforms in a screening programme for prostate cancer. Ann Clin Biochem. 2001;38:188-216 [Accessed May 30th, 2005. Available at http://www.leeds.ac.uk/acb/annals/annals_pdf/May01/188.PDF ] 6. Sturgeon CM. Practice guidelines for tumor marker use in the clinic. Clin Chem 2002; 48: 1151-1159 7. Association of Clinical Biochemists in Ireland: Guidelines for the use of tumor markers. 3rd ed. 2005. [Accessed May 7th, 2006. Available at http://www.acbi.ie/acbi-tmk.html] 8. Nonogaki H, FujiiS, Konishi I, Nanbu Y, Kobayashi F, Mori T. Serial changes of serum CA125 levels during menstrual cycles. Asia Oceania J Obstet Gynaecol 1994;17:369-378 9. Muyldermans M, Cornillie FJ, Koninckx PR. CA125 and endometriosis. Hum Reprod Update 1995;1:173-187 10. Singh R, Cahill D, Popert R, O’Brien TS.. Repeating the measurement of prostate-specific antigen in symptomatic men can avoid unnecessary prostatic biopsy. BJU Int 2003;92:932-935 +11. Sturgeon CM, McAllister EJ. Analysis of hCG: clinical applications and assay

اسلاید 88: CONCLUSION Optimal use of tumor markers requires care and attention to detail in the pre-analytical, analytical and post-analytical phases of analysis, and should be achievable in laboratories fulfilling the quality requirements described here.

اسلاید 89:

اسلاید 90:

اسلاید 91:

اسلاید 92: PSA & Free PSATotal PSA can also be used in the early detection of prostate cancer.And the use of % Free PSA aids in discriminating between prostate cancer and benign disease, thus helping to eliminate unnecessary biopsies. Therefore,it is imperative for manufacturers to provide reliable tumor marker assays which produce consistent laboratory results over time.ارجاع اسلاید به جدول کنترل شماره سریال و پایداری در فایل ضمیمه

اسلاید 93: The consistency of ARCHITECT tumor markersThe consistency of ARCHITECT tumor markers was previously reported at the 2001 ISOBM meeting which covered manufactured reagent lots over one to two years. This study is an extension of this previous report and reviewed the consistency of tumor marker serum panel values and control values produced in an artificial matrix as reported by the ARCHITECT assays covering manufactured reagent lots over four to five years.

اسلاید 94: tumor marker MethodsMethodsInternal quality control procedures at Abbott Laboratories require the testing of both serum panels and controls at various concentration levels throughout the assay range.

اسلاید 95: Serum control & patient The testing of serum panels imitates values expected with patient samples tested in clinical laboratories. The testing of controls validates reported patient results. Serum panels were prepared from patient samples or spiked analyte in a human serum matrix. These panels and controls were tested with each manufactured reagent lot of AFP, CA 19-9, CEA, Free PSA, and Total PSA over four to five years. Mean values and % coefficient of variation were determined for each level of serum panels and controls.

اسلاید 96: ConclusionConsistent results between manufactured lots were demonstrated for ARCHITECT AFP, CA 19-9, CEA, Free PSA, and Total PSA assays. Consistent performance over time allows laboratorians to have greater confidence in the results they provide to physicians resulting in better clinical decisions and management of patients. Physicians can be confident that changes in the concentrations of tumor markers in patients’ serum is indicative of changes in the patients’ disease status and not a result of variability in assay manufacturing

اسلاید 97: Dr mehrdad vanaki consultant QMS in medical labطرح کیفیت پیشنهادی بخش ایمونولوژی وهورمون

اسلاید 98: برنامه اجرائی کنترل کیفی داخلی ایمونولوژی و هورمونکاربرد روزانه سرم كنترل صحت و دقت در ردیف های کاری پانل هورمون و ایمونولوژی (نظیر کنترل صحت Biorad یا SERO) ( حداقل دو سطح از سه سطح ) و رسم منحني وستگارد مر بوطه جهت تست های کمی واصلی كنترل روزانه موارد غير طبيعي ( با همان نمونه اول ) در الايزا با روش تائیدی ايمونو آنالايزر Reconfirm of abnormal result of ElISA* method with ELFA ( Vidas) or ECLتكرار نتايج غير طبيعي با نمونه جديد در موارد عدم همخواني نتايج با شرح حال بيمار و سوابق نتايج قبلي بيمار Rechecked with new sample کنترل و تائید نتایج نمونه های بیماران (با نمونه قبلی) : استفاده از نمونه بیماران با نتایج بالا یا پائین به عنوان كنترل بیمار در رديف كار بعدي با دو هدف کنترل مجدد نتایج قبلی و شناسائی منابع خطا قبل از آنالیز Rechecked with same sample

اسلاید 99: برنامه اجرائی کنترل کیفی داخلی ایمونولوژی و هورموننکته مهم :برای تست های با کاربری زیاد نظیر پانل تیروئید رسم منحنی کنترل کیفی و رعایت قوانین وستگارد در دو سطح کنترل ضروری است ولی برای تست هائی با کاربرد محدود در بخش هورمون قرار دادن یک یا دو سرم کنترل به همراه یک نمونه بیمار از ران قبلی کار کفایت می کند در این شرایط بررسی عد خوانش شده با تارگت و محدوده کنترل کفایت دارد و بهتر است عدد خوانده شده حدود 1.4 حدود بالا و پائین سرم کنترل قرار گیرد

اسلاید 100: برنامه اجرائی کنترل کیفی داخلی ایمونولوژی و هورموننکته مهم 2:توجه به رفرانس رنج قبل از ورود هر سری اطلاعات بسیار الزامی و ضروری است

اسلاید 101: برنامه اجرائی کنترل کیفی داخلی ایمونولوژی و هورمون5) محاسبه ميانگين نتايج بيمارانPatient mean control در هر ردیف کاری و محاسبه ضریب تغییرات ماهانه تست ها در ارتباط با برخی تست های با اهمیت و دارای نوسان ازجمله T3 / TSH / Ferritin جهت شناسايي خطاهاي سيستماتيك قبل از آناليز يا حين آناليز 6) دلتا چك نتايج هورمون و ايمونولوژي Delta . Check :( مقایسه نتایج فعلی بیمار با نتایج قبلی و پرونده بیمار با هدف شناسائی خطا های راندوم)7) كنترل روزانه ارتباط تست ها با يكديگر Correlation . Check : بررسي ارتباط و همبستگی سطح فريتين سرم با سطح آهن سرم و مرفولوژي گلبولهاي قرمز يا رابطه ANA و RF و...

اسلاید 102: برنامه اجرائی کنترل کیفی داخلی ایمونولوژی و هورمون8) نگاهداری پیشگیرانه تجهیزات بخش هورمون و ایمونواسی (Daily & weekly & monthly PM) preventive maintenanceنکات کیفی و نگاهداری روزانه الایزا ریدر یا ایمونو آنالایزر یا سایر تجهیزات وابسته به بخش هورمون مطابق جدول نگاه دارنده پیشگیرانه دستگاه ها9) تصدیق و صحه گذاری کیت های جدید یا روش های جدید یا تجهیزات جدید : Verification & validation of new method & equipmentمقایسه دقت و صحت دو روش آزمایشگاهی برای یک نوع آزمایش یا دو کیت از یک نوع آزمایش به شکلی یک شرکت الزاما معتبر و داری تائیدیه کیفی باشد . انجام يك یا چند تست با نتیجه غير طبيعي با دو كيت الايزا متفاوت جهت مقايسه میزان خطی بودن وهمبستگی نتایج در اعداد بالا و پائین و بررسی مقایسه ای تکرار پذیری و صحت و حساسيت و ويژگي کیت جدید الایزا با کیت معتبر و مرجع الایزا

اسلاید 103: چک لیست کنترل بخش میکروبیولوژیچک لیست خود ارزیابی و کنترل بخش هورمون و ایمونولوژی

اسلاید 104: چک لیست کنترل بخش میکروبیولوژیچک لیست خود ارزیابی و کنترل بخش هورمون و ایمونولوژی

اسلاید 105: چک لیست کنترل بخش میکروبیولوژیچک لیست خود ارزیابی و کنترل بخش هورمون و ایمونولوژی

اسلاید 106: برنامه اجرائی تضمین کیفیت ایمونولوژی و هورمون1- آموزش مستمر کارکنان هورمون و ایمونولوژی در حوزه های کاربردی و بر اساس نیاز سنجی آموزشی 2- ارزیابی صلاحیت کارکنان هورمون و ایمونولوژی متناسب با نوع و حجم کار ( بدو خدمت و حین خدمت) در فرکانس زمانی تعریف شده (حداقل سالانه یک بار در حین خدمت ) توسط مسئول فنی و سوپر وایزر آزمایشگاه مبتنی بر شواهد عینی حین کار و سوابق کیفی ارائه شده توسط کارکنان3- پيگيري و ثبت روزانه عدم انطباق های بخش هورمون و ایمونولوژی در هر سه حوزه مرتبط با بخش میکرب شناسی شاملقبل از آنالیز(ارسال نمونه معیوب از نمونه برداری نظیر ظرف آلوده به دترژان و حجم ناکافی و...) حین آنالیز (استفاده از منحنی ذخیره الایزا و عدم استفاده از کالیبراتور ها در هر ردیف کاری ...)پس از آنالیز( ثبت جابجا نتایج تست ها در لیست کار / نداشتن کامنت های مناسب جهت تفسیر نتایج و ...) الف) ثبت عدم انطباق ها ( خطاهاي ) ماژور در فرم عدم انطباق بخش همراه با ثبت الزامي اقدام اصلاحي و پيشگيرانه ب) ثبت خطاي مينور در فرم عدم انطباق بخش بدون ضرورت ثبت اقدام اصلاحي و پيشگيرانه 4- برنامه اجرائی کنترل کیفی خارجی هورمون و ایمونولوژیالف) دریافت 3 نمونه سرم مجهول از موسسات کنترل کیفی خارجی ( موسسات مورد تائید آزمایشگاه رفرانس) در فواصل 4 ماهه ب) دریافت و ارسال نمونه های مشکوک یا مجهول از آزمایشگاه های ریفرال و معتبر نظیر ارسال نمونه با جواب مثبت ضعیف ( ارزیابی مقایسه ای نتایج مشکوک در بخش هورمون و ایمونولوژی) 

اسلاید 107: آزمون تائید صلاحیت پرسنل ایمونولوژی و سرولوژی

اسلاید 108: Principle of immunoassay

اسلاید 109: labeled materialAll immunoassays require the use of labeled material in order to measure the amount of antigen or antibody present. A label is a molecule that will react as part of the assay, so a change in signal can be measured in the blood:reagent solution.

اسلاید 110: Examples of a labelExamples of a label include a radioactive compound, an enzyme that causes a change of color in a solution, or a substance that produces light. The label can be applied during the manufacture of the reagent to either the antibody (Ab*, see Figure 1-5) or antigen (Ag*, see Figure 1-6). Immunoassay technologies utilize different formats to distinguish the bound antigen-antibody complex from the free unbound label.

اسلاید 111:

اسلاید 112: Competitive and Noncompetitive ImmunoassaysThe measurement of analyte in an immunoassay is achieved by using either a competitive or a noncompetitive format.

اسلاید 113: Competitive Format In competitive formats, unlabelled analyte (usually antigen) in the test sample is measured by its ability to compete with labeled antigen in the immunoassay. The unlabeled antigen blocks the ability of the labeled antigen to bind because that binding site on the antibody is already occupied.

اسلاید 114: Con’tedThus, in a competitive immunoassay, less label measured in the assay means more of the unlabeled (test sample) antigen is present. The amount of antigen in the test sample is inversely related to the amount of label measured in thecompetitive format (Figure 1-7).

اسلاید 115: One step competitive formatIn the one step competitive format (see Figure 1-8), both the labeled antigen reagent (Ag*) and the unlabeled specimen (or test sample analyte) compete for a limited amount of antibody.

اسلاید 116: Two step competitive formatIn the two step competitive format, the antibody concentration of the reaction solution is present in excess in comparison to the concentration of antigen. Antibody reagent is first incubated with specimen containing antigens of interest; then in the second step, labeled antigen is added. Remember that in the competitive format, less bound labeled antigen indicates more antigen present in the test sample. Two step competitive assay formats provide several fold improved assay sensitivity compared to one step assay formats.

اسلاید 117:

اسلاید 118: Noncompetitive (Sandwich) MethodNoncompetitive assay formats generally provide the highest level of assay sensitivity and specificity and are applied to the measurement of critical analytes such as cardiac and hepatitis markers. This format is referred to as a “sandwich” assay because analyte is bound (sandwiched) between two highly specific antibody reagents (Figure 1-10).

اسلاید 119:

اسلاید 120: Noncompetitive assayNoncompetitive assay formats can also utilize either one step or two step methods, as with the competitive assay. The two step assay format employs wash steps in which the sandwich binding complex is isolated and washed to remove excess unbound labeled reagent and any other interfering substances.The two step noncompetitive format usually offers the highest specificity and sensitivity of all the assay formats discussed here.

اسلاید 121:

اسلاید 122:

اسلاید 123: Chemiluminesence Immuno Assay CIADr mehrdad vanaki Consultant of QMS & QA in medical lab

اسلاید 124: مقدمهتکنولوژی که به تازگی طراحی گردیده و به نام کمی لومینسانس می باشد و بر اساس اندازه گیری محصول نهائی ( نور) می باشد . در واکنش کمی لومینسانس تحت اثر اکسیژن یا پراکسید ها بر روی برخی مواد معدنی منجر به برگشت الکترون به مدار پایه می گردد که این برگشت الکترون با آزاد سازی انرژی نوری بوده یا به عبارتی انرژی آزاد شده از ملکول ها به صورت تولید نور یا فوتون افشانی خواهد بود . میزان فوتون افشانی در واکنش های بیولومینسانس چندین برابر واکنش های کمی لومینسانس می باشد .میزان حساسیت روش کمی لومینسانس از روش رادیوایمونواسی و فلوئوروایمونواسی بیشتر است و حساسیت روش فلوئوروایمونواسی نیز از روش انزیم ایمونواسی بیشتر می باشد.21-10 -109

اسلاید 125: مقایسه حساسیت سنجش در انواع روش های ایمونواسی

اسلاید 126: Chemiluminesence کمی لومینسانس تاریخچه: اولین بار انسان نور کمی لومینسانس را در کرم شب تاب پیدا نمود که شامل انرژی نورانی حاصل از فوتون های آزاد شده بدون دخالت حرارت می باشد مفاهیم اولیه روش کمی لومینسانس ایمونواسی :اصول کمی لومینسانس مشابه سایر روش های ایمونو اسی است (نظیر رادیو ایمونو اسی / آنزیم ایمونواسی / فلوئوروایمونو اسی و...) با این تفاوت که لیبل بکار گرفته شده به عنوان اندیکاتور ایمونو اسی شامل لومینول و آکریدینیوم یا ایزولومینول می باشد لومینول با تاثیر بر روی ملکول ها منجر به تولید فوتون و مجموعه فوتون های نوری توسط دستگاه لومینومتر( فوتون سنج) و توسط یک سیستم فتومولتی پلایر دتکتور تبدیل به انرژی الکتریکی شده و به صورت دیژیتال و کمی نشان داده می شوند

اسلاید 127: Chemiluminesence کمی لومینسانس گرچه لومینول اولین نشانگری است که مورد استفاده واقع شده ولی ایزو لومینول کارآئی بهتری دارد این واکنش با افزودن مخلوطی از پراکسید هیدروژن و یک کاتالیست اجرا می شود

اسلاید 128: Chemiluminesence مزایای روش کمی لومینسانس نسبت به سایر روش های ایمونواسی1- حساسیت بسیار بالا روش کمی لومینسانس :مزیت غالب روش کمی لومینسانس به سایر روش های ایمونو اسی حساسیت بالا روش می باشد و در برخی متدها تا حد زپتامول (21- 10) می باشد / حساسیت کمی لومینسانس هزاران برابر بیشتر از روش الایزا و رادیو ایمونو اسی می باشد این موضوع منجر به کاهش دفعات تکرار بی مورد تست ها و مقرون به صرفه شدن این گروه از آزمایشات گردیده است ) 2- دقت و تکرارپذیری مناسب روش کمی لومینسانس نسبت به سایر روش ها به دلیل تاثیر پذیری کمتر این روش از عوامل محیطی و پایداری بیشتر معرف ها3- ویژگی و اختصاصیت بالا روش کمی لومینسانس 4- نیمه عمر طولانی و پایداری کیت های کمی لومینسانس نسبت با رادیو ایمونو اسی و الایزا 5- گستردگی تست های قابل انجام با روش کمی لومینسانس به دلیل حساسیت و ویژگی مناسب و بالا روش و امکان اندازه گیری غلظت های بسیار پائین آنالیت 6- کم خطر و ایمن بودن روش کمی لومینسانس نسبت به سایر روش های ایمونواسی 7- استفاده از روش کمی لومینسانس به عنوان روش مرجع از جمله کاربرد فاز گازی کمی لومینسانس به عنوان ردیاب در روش مرجع کروماتوگرافی گازی8- عدم نیاز به منبع نوری و فیلتر خاص و نداشتن محدودیت های روش رنگ سنجی الایزا

اسلاید 129: تفاوت کمی لومینسانس و الکترو کمی لومینسانس CL & ECLدر روش کمی لومینسانس انرژی اولیه جهت تهییج اتم ها به واسط یک واکنش شیمیائی تامین می گردد در حالی که در روش الکترو کمی لومینسانس انرژی اولیه جهت تهییج اتم ها به کمک انرژی الکتریکی حاصل از یک واکنش الکتروشیمیائی تامین می گردد در هردو حالت پس از تهییج اتم ها و در برگشت به حالت پایه فوتون ساطع می گردد و فوتون های ساطع شده توسط فوتون سنج یا لومینومتر اندازه گیری کمی یا دیژیتال می شوند

اسلاید 130: الکترو کمی لومینسانس ECLدر روش الکترو کمی لومینسانس اکسیداسیون الکترو شیمیائی استر آکریدین در حضور آب اکسیژنه منجر به تولید کمی لومینسانس آبی رنگ می گردد که در طول موج 430 خوانش می گردد الکترود های دستگاه الکترو کمی لومینسانس معمولا در مجاورت محلول قرار گرفته و نور منتشره بین سطح الکترود و محلول توسط دتکتور اندازه گیری می گردد

اسلاید 131: Classification of Chemiluminesence سرعت واکنش کمی لومینسانس واکنش کمی لومینسانس به لحاظ سرعت واکنش به دو گروه زیر تقسیم می شوند: واکنش فلاش Flash method در طول 0.5 تا 3 ثانیه شروع و به اوج می رسد و در طول 2 الی 4 ثانیه کامل از بین رفته و حذف می گردد ویژگی مثبت واکنش فلاش حساسیت بسیار بالا روش (در حد اتو مول) است که کاربرد آن را محدود به آزمایشگاه های مرجع و تحقیقاتی می نماید ویژگی های منفی روش فلاش گرانی روش و کوتاه بودن زمان واکنش است که جهت خوانش فوتون ها الزاما دتکتور باستی در مجاورت نزدیک با سیستم واکنش باشد که به محض آزاد شدن فوتون ها خوانش با دتکتور انجام گردد واکنش گلاو GLOW methodدر طول 2 الی 7 دقیقه به اوج رسیده و به مدت 20 الی 30 دقیقه پایدار و ثابت باقی می ماند ویژگی مثبت روش گلاو کاربرد آن در آزمایشگاه های بالینی روتین است که به دلیل ثبات و پایداری سیگنال های نهائی و امکان بازخوانی مجدد تست ها در این روش می باشد ویژگی منفی روش گلاو حساسیت آن است که کمی کمتر از روش فلاش می باشد

اسلاید 132: Chemiluminesence معیار های مناسب در خرید سیستم کمی لومینسانس 1- خرید لومینومتر استاندارد و دارای تائید یه بین المللی و تائیدیه صحت و دقت (صحه گذاری ) در شرکت پشتیبان و آزمایشگاه ها 2- پشتیبانی و خدمات پس از فروش با سطح بالا ( تحقیق و استعلام اعتبار شرکت پشتیبان از مراکز نصب شده / ترجیحا نماینده انحصاری یا اصلی)3- دارا بودن سیستم باز کیت کمی لومینسانس یا سیستم بسته با اعتبار بالا و تنوع گسترده در تست های قابل انجام 4- قیمت مناسب کیت ها ی سیستم متناسب با تعرفه های آزمایشگاهی ایران 5- ترجیحا استفاده از سیستم های فول اتومیشن کمی لومینسانس به دلیل کاهش قابل ملاحظه خطا های پرسنلی 6- دارا بودن حداقل حساسیت در روش های کمی لومینسانس ( فمتو 15- 10)

اسلاید 133: ELISA TROUBLESHOOTINGDr. mehrdad vanaki88/10/17

اسلاید 134: تعریف و طبقه بندی روش الایزا ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assayسنجش ایمونومتریک واکنش انتی ژن و آنتی بادی با هدف جستجوی انتی ژن یا آنتی بادی بواسطه آنزیم های لیبل شدهطبقه بندی انزیم ایمونواسی : 1- هموژنوس انزیم ایمونواسی : واکنش فاقد مرحله شستشو و جداسازی بوده و اندازه گیری بر اساس تغییرات فعالیت آنزیم می باشد (کاربرد در اندازه گیری سطح داروها ) 2- هتروژنوس انزیم ایمونواسی: روش مبتنی بر فاز جامد بوده و دارای مرحله شستشو و جداسازی می باشد و انزیم در این روش صرفا یک اندیکاتور جهت تایید حضور کمپلکس انتی ژن و انتی بادی می باشد (عمده روشها از این گروه می باشد) روش هتروژن انزیم ایمونو اسی دو نوع رقابتی و غیر رقابتی تقسیم می گردد .

اسلاید 135: الایزا ساندویچ Elisa SandwichAb sandwich or Ag Captureدر این روش یک آنتی ژن در بین دو آنتی بادی اختصاصی قرار می گیرد و ساندویچ می گردد و شایعترین روش الایزا محسوب می گردد مثل تست PSA/TSH/FSH/LH/HCG در روش آنتی ژن کپچر یا آنتی بادی ساندویچ ملکول آنتی ژن حداقل بایستی دارای دو سایت یا ناحیه آنتی ژنیک متفاوت باشد Ag Sandwich or Ab Capture این روش که برای جستجوی آنتی بادی به کار می رود یک ملکول آنتی بادی بین دو ملکول انتی ژن ساندویچ و کاپچر می گردد .

اسلاید 136: Antibody captureب) روش Antibody capture1-Ag sandwich or direct Ab captureاين روش براي تعيين سنجش آنتي بادي مورد استفاده قرار مي گيرد بدين صورت كه از يك آنتي ژن كوت شده بر روي فاز جامد براي به دام انداختن آنتي بادي اختصاصي آن استفاده مي شود و همان آنتي بادي از طريق بازوي ديگر خود (Fab) پذيراي همان آنتي ژن اما به صورت نشان دار مي باشد در نتيجه آنتي بادي اختصاصي در بين 2 آنتي ژن ساندويچ مي گردد .در اين روش آنتي بادي توتال از هر كلاس ايمونوگلوبولين ميسر است و يكي از اختصاصي ترين و حساس ترين روش ها براي تشخيص آنتي بادي در نمونه است مثال بارز اين روش كيت اندازه گيري آنتي بادي بر عليه پلاسموديوم ويواكس و ترپونماپاليدوم و HBs Ab مي باشد.2-Indirect Ag Sandwich or Indirect Ab capture در اين روش پس از به دام انداختن آنتي بادي توسط آنتي هيومن گلوبولين كوت شده در كف چاهك ها با اضافه كردن آنتي ژن اختصاصي و تشكيل كمپلكس از يك آنتي بادي اختصاصي نشان دار بر عليه آنتي ژن به عنوان سيستم شناساگر استفاده مي شود.

اسلاید 137: الایزا رقابتی و مهاری Elisa Competetive & Blocking الایزا رقابتی : Elisa Competetiveاگر هردو آنالیت یا آنتی بادی نشاندار و غیر نشاندار با هم (همزمان) به محیط اضافه شوند روش الایزا رقابتی نامیده می شود الایزا مهاری : Elisa Blockingابتدا آنالیت یا آنتی بادی غیر نشاندار ( نمونه بیمار) اضافه شده و پس از یک دوره انکوباسیون ( با شستشو یا بدون شستشو) در مرحله بعدی آنالیت یا آنتی بادی نشاندار اضافه می گردد

اسلاید 138: الايزای رقابتی يا مهاریدر روشهاي رقابتي اساس سنجش بر رقابت دو آنتي ژن يا دو آنتي بادي ( كه يكي از آن دو نشاندار است) براي اتصال به ليگاند با مقدار محدود استوار است. اگر هر دو آناليت نشاندار و غير نشاندار با هم به سيستم اضافه شوند روش را رقابتي مي نامند ولي چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يك دوره انكوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاري يا بلاكينگ مي نامند. در روش مهاري ممكن است در بين 2 مرحله و قبل از اضافه نمودن آناليت بعدي شستشو انجام شود يا انجام نشود مثال بارز روشهاي رقابتي و مهاري سنجش 4T3,T مي باشد. انواع روشهاي رقابتي عبارتند از:

اسلاید 139: الايزای رقابتی يا مهاریالف) روش رقابتي يا مهاري براي انتي ژن:اساس اين روش بر رقابت بين آنتي ژن نشاندار و آنتي ژن موجود در نمونه براي اتصال به يك آنتي بادي اختصاصي كوت شده در چاهك استوار است. در اين روش مقدار آنتي بادي كوت شده بايد محدود باشد و ملكول سيگنال دهنده همان آنتي ژن نشاندار است, اساس RIA و EIA كلاسيك به همين روش استوار است.در اين روش منحني پاسخ- دوز به صورت معكوس خواهد بود, بدين معني كه آناليت نشاندار در حضور مقادير زيادي از آناليت غير نشاتندار موجود در نمونه به مقدار كمتري به آنتي بادي متصل مي شود و در نتيجه سيگنال هم بوجود خوههد آمد.محدوده تعيين آناليت با اين روش ممكن است بوسيله استفاده از مولكول نشاندار با فعاليت اختصاصي زياد تقويت شود اما حداقل مقدار قابل تشخيص (كمترين مقدار از آناليت كه قابل تشخيص خواهد بود) توسط تمايل آنتي بادي مورد استفاده تعيين مي شود, با اين وجود غلظتهاي خيلي كم از هاپتن ها عموما توسط همين روش قابل تعيين اند و حساس ترين روشي است كه مي تواند مقدار كمتر fmol را هم تشخيص دهد.در برخي از موارد نشاندار كردن روي خصوصيات هاپتن اثر مي گذارد در نتيجه در روش رقابتي براي تعيين آنتي ژن از يك آنتي بادي نشاندار استفاد مي شود, در اين نوع از سنجش ها اين مطلب ضروري است كه فاز جامد توسط آنتي ژن با مقدار كم و ثابت پوشيده مي شود, در اين روش آناليت موجود در نمونه با آناليت كوت شده در چاهك براي اتصال به آنتي بادي نشاندار رقابت مي كند. در اينجا هم منحني استاندار معكوش است, از اين روش بيشتر براي سنجش به روش كمي لومينسانس استفاده مي شود.

اسلاید 140: الايزای رقابتی يا مهاریب)روش رقابتي براي آنتي بادي:دراين روش رقابت بين دو آنتي بادي يكي در نمونه به صورت غير نشاندار و يكي به صورت نشاندار شده با آنزيم برا اتصال به يكي آنتي ژن كوت شده در چاهك صورت مي پذيرد, بديهي است كه هر چه مقدار آنتي بادي نمونه بيشتر باشد انتی بادي نشاندار كمتري به چاهكها متصل شده و سيگنال نيز كمتر خواهد بود و در نتيجه منحني استاندارد نيز معكوس مي باشد, شاخص ترين مثال اين روش اندازه گيري آنتی بادی بر ضد HBc &HBc Ab است

اسلاید 141:

اسلاید 142: )الايزاي مستقيمDIRECT ELISA)در اين روش آنتي ژن يا آنتي بادي موجود در نمونه ي كه بايد تشخيص داده شود به طور مستقيم بر سطح فاز جامد كوت مي شود و سپس آنتي بادي يا آنتي ژن مكمل آن كه نشان دار شده است به سيستم اضافه ميشود. در صورت وجود آنتي ژن يا آنتي بادي مورد نظر در نمونه ي سيگنال مناسب ايجاد مي شود. اين روش مشابه ايمونوفلورسانس مستقيم است اما كاربرد چنداني در كيت هاي تشخيصي ندارد و بيشتر در كارهاي تحقيقاتي استفاده مي شود

اسلاید 143: ) الايزاي غیرمستقيمindirect ELISA)اين روش براي تعيين آنتي بادي اختصاصي و يا تيتراسيون آنتي بادي در نمونه هاي سرم مورد استفاده قرار مي گيرد. اساس آزمايش بدين نحو است كه معمولا سرم رقيق شده به آنتي ژن هاي كوت شده در فاز جامد (ميكرو ول يا چاهك) اضافه مي شود. آنتي ژن كوت شده آنتي ژت اختصاصي مربوط به آنتي بادي است كه قرار است در نمونه رديابي شود پس از افزودن نمونه و طي زمان انكوباسيون و يك مرحله ي شستشو آنتي هيومن گلوبولين نشان دار شده با آنزيم به چاهك اضافه مي شود بر حسب اينكه چه كلاسي از انتي بادي براي رديابي اهميت دارد نوع آنتي Ig مورد استفاده نيز متفاوت است مثلا براي رديابي آنتي بادي كلاس IgG از انتي هيومن IgG و براي رديابي كلاس IgA از آنتي هيومن IgA استفاده مي شود.

اسلاید 144: Antibody capture ELISAاختصاصيت سنجش مستقيما توسط آنتي ژن كوت شده در فاز جامد تعيين مي شود كه ممكن است كاملا خالص و اختصاصي باشد و يا نسبتا خام و غير اختصاصي باشد . سرم حاوي انتي بادي اختصاصي مي تواند در يك بافر براي جلوگيري از جذب غير اختصاصي پروتئين ها و جلوگيري از اشغال نقاط اتصال آنتي ژن رقيق شود. به چنين بافري محلول رقيق كننده نمونه sample diluent گفته مي شود. حساسيت و ويژگي چنين روشهايي مي تواند با به كار گيري روش Antibody capture با كاهش تداخل اثر آنتي بادي غير اختصاصي بهتر شود.بهترين مثالها در مورد اين روش تعيين آنتي بادي بر عليه توكسوپلاسما,روبلا ,ويروس سيتومگال و هليكوباكترپيلوري از كلاسهاي IgMو IgAوIgG در سرم مي باشد.البته امروزه براي تعيين IgM بر عليه اين عوامل عموما از روش capture استفاده مي شود در روش capture آنتي بادي هاي موجود در نمونه از كلاسIgM به روي چاهك هاي كد شده با آنتي هيومن IgM جذب شده و سپس براي تشخيص , از آنتي ژن اختصاصي مربوطه كه آنزيم نشان دار شده اسنت و يا آنتي بادي نشان دار ضد آن به صورت مزدوج استفاده مي شود.

اسلاید 145: ELISA TROUBLESHOOTINGNo Signal or Weak SignalHigh BackgroundPoor DuplicatePoor Standard CurvePoor LinearityPoor Assay SensitivityPoor CorrelationUnexpected Clinical ClassificationApparent Shift in Reference Interval

اسلاید 146: ELISA Stage

اسلاید 147: No Signal or Weak SignalOmission of key reagentsCollection systemScratchincubationIncorrect time or temperatureWash too stringentInactivation of conjugateInactivation, Incomplete or incorrect preparation of chromogen Wrong filterExpire date, incorrect storage, reagent not to RT

اسلاید 148: No Signal or Weak Signal1- حذف یکی از معرف های کلیدی نظیر کنژوکه در روش اجرائی کار منجر به سیگنال منفی ( عدم واکنش ) می گرددافت تیتر کنژوکه غیر فعال شدن کنژوگه ) یا کاهش اثر ترکیب سوبسترا و کروموژن که معمولا به دلیل آلودگی معرف ها یا در انتهای مصر ف هر کیت ( در مراکزی که تعداد نمونه کم بوده و کیت مکررا و در چندین نوبت مورد استفاده قرار می گیرد ) 2- خروج از کالیبر ابزار های حجمی برداشت نمونه و استاندارد منجر به کاهش سیگنال نهائی می گردد به عنوان مثال اگر از منحنی استاندارد ذخیره شده در حافظه دستگاه استفاده نمائیم و ابزار حجمی در حین کار از کالیبر خارج گردد به دلیل اینکه تست و استاندارد در هر ردیف کاری همزمان گذاشته نمی شوند در صورت کاهش برداشت حجم نمونه درسیگنال مربوط به تست ها کاهش و ضعف ایجاد می گردد و نتایج منفی کاذب یا مثبت کاذب بسته به نوع منحنی حاصل می نماید3- خراش در کف پلیت ها می تواند منجر به کاهش سیگنال شود4- کاهش زمان انکوباسیون یا دمای انکوباسیون بر خلاف دستور العمل کیت منجر به کاهش سیگنال می گردد که به دلیل کاهش تعداد ترکیب های اتصالی نهائی می باشد

اسلاید 149: No Signal or Weak Signal5- شستشو بیش از تعداد دفعات تعریف شده و یا استفاده از بافر با پ هاش نامناسب یا دچار آلودگی باکتریال و قارچی منجر به دفع واکنش های اختصاصی ایمن کمپلکس و نهایتا افت و کاهش سیگنال یا رنگ نهائی می گردد 6- کاربرد فیلتر نامناسب در الایزا منجر به کاهش سیگنال می گردد7- شروع انجام تست الایزا بدون انتظار جهت به دمای اطاق رساندن معرف ها و پلیت های کیت الایزا از جمله عوامل شایع افت سیگنال و کاهش رنگ می باشد8- حرارت پائین محیط کار بخش الایزا ( خراب بودن سیستم گرمایش آزمایشگاه) منجر به افت سیگنال و رنگ دهی واکنش و بسته به واکنش غیر رقابتی یا رقابتی منجر به افت یا افزایش کاذب مقادیر تست ها می گردد ( خصوصا در شرایط که تست ها بدون استاندارد همزمان خوانده شوند )

اسلاید 150: HIGH BACKGROUNDChromogen exposed to light Incorrect assay temperatureInadequate washingImproperly set up blankWrong filter in ELISA readerEvaporation of well during incubationConcentration of conjugate too highContamination of pipette , dispenser or substrate with conjugateCross contamination from other specimen or positive controlContaminated substrate solution with metal ions or oxidizing reagentContaminating enzyme present in sample

اسلاید 151: HIGH BACKGROUND1- آلودگی چاهک به چاهک نمونه بیماران به دلیل مجاورت با کنترل مثبت یا استاندارد یا نمونه مثبت مجاور 2- افزایش زمان انکوباسیون یا دمای انکوباسیون بر خلاف دستور العمل کیت منجر به افزایش سیگنال می گردد که به دلیل افزایش تعداد ترکیب های اتصالی نهائی می باشد 3- شستشو کمتر از تعداد دفعات تعریف شده و یا استفاده از بافر با پ هاش نامناسب یا دچار آلودگی باکتریال و قارچی منجر به عدم دفع واکنش های غیر اختصاصی و نهایتا افزایش سیگنال یا رنگ نهائی می گردد 4- کاربرد فیلتر نامناسب در الایزا منجر به افزایش سیگنال می گردد5- حرارت بالا محیط کار بخش الایزا ( خراب بودن سیستم سرمایش آزمایشگاه خصوصا در مناطق گرم و مرطوب شمال یا جنوب کشور) منجر به تغییر سیگنال و رنگ دهی واکنش و بسته به واکنش غیر رقابتی یا رقابتی منجر به افت یا افزایش کاذب مقادیر تست ها می گردد ( خصوصا در شرایط که تست ها بدون استاندارد همزمان خوانده شوند )

اسلاید 152: HIGH BACKGROUND6- افزایش غلظت و تیتر کنژوکه کیت الایزا به دلیل تبخیر یا تغلیظ ( باز ماندن درب ظرف کنژوکه به مدت طولانی در حرارت اطاق در چند نوبت مکرر) یا اشتباه کارخانه سازنده در تعیین تیتر مناسب 7- تبخیر و تغلیظ نمونه های استاندارد کیت به دلیل باز ماندن طولانی درب ویال استاندارد ها در چند نوبت مکرر8- آلودگی پیپت و دیسپنسر مورد استفاده برای سوبسترا با معرف کنژوکه / عمدتا به دلیل اشتباه پرسنلی و استفاده مشترک از یک پیپت است 9- آلودگی سوبسترا به یون های فلزی و اکسیدان ها یا مجاورت با نور که منجر به تشکیل رنگ زمینه ای آبی پر رنگ ( پس از اختلاط سوبسترا و کروموژن) قبل از مجاورت با پلیت می گردد (جهت سوبسترا و کروموژن تیمیدین متیلن بلو)

اسلاید 153: Poor DuplicatePipetting error of standard samplePlate scratchTransfer liquid from well to wellIncorrect dispensing of reagentsParticulate or precipitate in sampleDirty microwellEdge effect

اسلاید 154: Poor Duplicate نمونه مضاعف ضعیف (بدون هم خوانی )1- نمونه خوب میکس نشده ( نمونه خارج شده از فریزر و دارای شیب غلظتی و رسوب ) 2- خراش زیر پلیت 3- دیسپنسینگ نادرست نمونه یا معرف ها در پلیت4- اثر لبه ای 5- چاهک آلوده یا بی اثر 6- آلودگی چاهک به چاهک

اسلاید 155: Poor Standard CurvePlate not cleanPoor mixing of reagentsPipetting error poor dilutionPlate scratchImproper , insufficient washingReagent from different kit or different lot

اسلاید 156: Poor Standard Curve1- استفاده از معرف یا استاندارد یک کیت دیگر خصوصا با سری ساخت متفاوت 2- خطا در حین آماده سازی استاندارد ها ناشی از پیپتینگ نامناسب و ...3- اختلاط نامناسب استاندارد ها 4- خراش و کدورت کف پلیت ها در ناحیه استاندارد ها 5- کف پلیت کثیف و تمیز نشده 6- شستشوی نادرست یا ناکافی

اسلاید 157: ویژگی های منحنی استاندارد یا کالیبراسیونCalibration curve or Dose Response Curve منحنی استاندارد چون رابطه بین دوز آنالیت و پاسخ ( جذب نوری یا سیگنال حاصل) را بیان می نماید به عنوان منحنی دوز – پاسخ نیز نامیده می شود در شرایط ایده آل منحنی کالیبراسیون یا استاندارد بایستی یکنواخت ( منو تونیک ) باشد یا به عبارتی منحنی تغییر جهت نداشته باشد ( فاقد قله یا دره در میانه منحنی باشد)منحنی های استاندارد در دو نوع کلی طبقه بندی می گردند: 1- منحنی شیب مثبت : رابطه دوز و پاسخ ( سیگنال) مستقیم است2- منحنی شیب منفی : رابطه دوز و پاسخ ( سیگنال) غیرمستقیم استافزایش تعداد استاندارد ها یا کالیبراتور ها منجر به افزایش صحت و کاهش بایاس منحنی کالیبراسیون می گردد

اسلاید 158: Poor Assay SensitivityIncomplete mixing of zero calibratorDirty tube or wellsVariation of wellsKit lot at faultIncomplete mixing of reagents Kit reagents not allowed to RTPoor kit design or optimizationInsufficient slop of curve at very low concentrationDeterioration of kit during shelf life or exposure to extreme temperature

اسلاید 159: Poor Assay Sensitivity حساسیت ضعیف سنجش1- میکسینگ ناقص راژنت ها و نمونه ها 2- به حرارت اطاق نرساندن کیت های الایزا قبل از مصرف3- عدم استفاده از کالیبراتور صفر در تست یا اختلاط ناقص کالیبراتور صفر 4- تفاوت و تنوع در چاهک ها 5- آلودگی لوله ها به دترژان و..6- فساد معرف ها و پلیت کیت الایزا قبل از تاریخ انقضا به دلیل حرارت نامناسب محیطی و استفاده مکرر7- شیب ناکافی منحنی استاندارد در غلظت های پائین 8- نقص در سری ساخت کیت

اسلاید 160: Poor Correlation Between Two KitsLimited range of concentration usedUsed of old samplesLimited number of patient sample used for studyKit lot at faultIncorrect Standardization of Kit Instability of reference standardCurve fit bias with either or both kitsOnly one or two assay performedEquipment faultUse of different units or international standard

اسلاید 161: Poor Correlation Between Two Kits همبستگی پائین نتایج دو کیت 1- استفاده از کیت غیر استاندارد2- ناپایداری استاندارد های مرجع3- رنج محدود استاندارد ها در کیت الایزا4- استفاده از تجهیزات متفاوت و غیر کالیبر5- تعداد محدود نمونه بیماران در مطالعه مقایسه ای دو روش به نوان مثال در بررسی مقایسه ای دو کیت یا دو روش برای یک تست بایستی حداقل 10 نمونه در سه سطح غلظتی متفاوت مورد ارزیابی قرار گیرد تا اختلاف معنی دار حاص قابل ارزیابی باشد 6- انجام یک با رتست روی هر نمونه بیمار / بهتر است هر نمونه حداقل دو تا سه بار انجام شود و میانگین آن مورد استناد قرار گیرد7- استفاده از دو نوع واحد استاندارد بین المللی در گزارش نتایج8- نقص درسری ساخت کیت

اسلاید 162: Unexpected or Inconsistent Clinical ClassificationIncomplete mixing or warming up of reagentsInterference by cross reactant (drug metabolites)Change in protocolKit lot at faultUnusual type of patient sample High dose hook effectPoor assay designUse incorrect uniteError or instability in store calibration curveEquipment faultIncorrect storage of sample or reagentsWrong sample tested or wrong label

اسلاید 163: Unexpected or Inconsistent Clinical Classification عدم انطباق نتایج کیت با انتظارات بالینی1- استفاده از نمونه نادرست و غیر معمول بیمار ( غیر ناشتا / همولیز القائی / لیپمیک و آلوده ...)2- اثر قلابی با دوز بالا مثل بتا ساب یونیت / فریتین / پرولاکتین 3- تداخل تست الایزا با متابولیت های داروئی و غیر داروئی / ویژگی پائین کیت 4- اختلاط ناکافی نمونه و راژنت ها / گرم کردن نامناسب کیت5- ذخیره سازی نامناسب نمونه بیمار 6- خطا در تجهیزات7- واحد نادرست تست8- ناپایداری منحنی استاندارد ذخیره9- نقص در سری ساخت کیت10- اشتباهات و خطا های پرسنلی ( راندوم مثل جابجا ریختن نمونه دو بیمار یا کم وزیاد ریختن نمونه یا معرف در یک چاهک / سیستماتیک مثل کم یا زیاد شستن پلیت ها / عادت به خواندن توام با تاخیر پلیت ها / سرعت پائین دست پرسنل در زمان ریختن یا برداشتن نمونه و معرف ها

اسلاید 164: Apparent Shift in Reference IntervalChange in protocolUse of expired kitChange in sample collection method Change in technicianChange in curve fit programError or instability in store calibration curveEquipment faultChange in laboratory temp/humidityPoorly calibrated or unstable calibrator

اسلاید 165: جابجائی آشکار نتایج در محدوده مرجع 1- تعویض تکنسین 2- تغییر عمده در روش جمع آوری نمونه 3- تغییر عمده در حرارت و میزان رطوبت آزمایشگاه4- کالیبراتور ناپایدار 5- عدم اطلاع تکنسین از تغییر روش کار متد الایزا6- کاربرد منحنی کالیبراسیون ذخیره 7- نقص در تجهیزات نظیر الیزا ریدر 8- کیت تاریخ گذشته

اسلاید 166: ALL WELL YELLOWContaminated substrateContaminated stop solutionIncorrect dilutionInefficient washing

اسلاید 167: ALL WELL CLEARELISA not performed correctlyContaminated conjugateIncorrect storage of kitOver washing of plate

اسلاید 168: منابع خطا شایع در روش انزیم ایمونو اسی 1- حداکثر زمان مجاز جهت نگاه داری خون کامل جدا نشده در 37 درجه 5 دقیقه می باشد ( زمان طولانی تر علاوه بر تخریب ساختار پروتئینی برخی هورمون ها و انالیت های حساس منجر به ازاد سازی برخی فاکتور های سرمی در محیط شده که منجر به افزایش کاذب جذب می گردد2- نمونه حتی الامکان نبایست همولیز / لیپمیک یا ایکتریک باشد دلیل ان تداخل رنگ اضافی در واکنش رنگ سنجی الایزا ریدر است 3- نمونه های هورمون یا سایر انالیت ها حداکثر تا 48 ساعت بدون شرایط انجماد در یخچال 2 الی 8 درجه قابل نگاه داری است و در زمان های بالای 48 ساعت بهتر است در 20 – فریز و نگاه داری گردد4- ذوب و فریز مکرر نمونه منجر به کاهش سطح هورمون های سرم خصوصا هورمون های تیروئیدی می گردد لذا بهتر است اگر نمونه سرم در چند ردیف کاری نیاز به ذوب دارد در چند ویال فریز و در هر نوبت یک ویال دفریز گردد در ضمن نمونه سرم که از فریزر خارج می گردد به دلیل شیب غلظتی که در ته لوله حاصل شده است بایستی به خوبی قبل از استفاده میکس گردد و به حرارت اطاق رسانده شود .

اسلاید 169: منابع خطا شایع در روش انزیم ایمونو اسی 5- اجزا کیت پس از خروج از یخچال الزاما بایستی به حرارت اطاق و تعادل دمائی با محیط برسد. دمای پایین با کاهش سرعت واکنش انزیمی منجر به ایجاد جذب های غیر یکنواخت خصوصا در استریپ های ابتدائی پلیت می گردد 6- رطوبت محیط کار ایمونواسی بایستی کمتر از 70% درصد باشد 7- اسیدی یا قلیائی شدن بافر (به دلیل الودگی قارچی یا باکتریال) منجر به افزایش یا کاهش کاذب جذب می گردد و پ هاش اپتیمال پروسه فعالیت انزیمی را از بین می برد لذا تهیه تازه به تازه بافر مورد نیاز در هر ردیف کاری قابل توصیه می باشد .8- دمای محیط آزمایشگاه بایستی 20 تا 25 درجه باشد و با دماسنج دقیق روزانه کنترل و ثبت گردد . دمای بالا محیط افزایش کاذب جذب و بالعکس حاصل می نماید

اسلاید 170: منابع خطا شایع در روش انزیم ایمونو اسی 9-تغییرات دمائی مجاز انکوباتور 37 درجه 2+- درجه می باشد . اثر لبه ای Edge effectخطای ناشی از شوک حرارتی به پلیت در انزیم ایمونو اسی می باشد که در قسمت مجاور درب انکوباتور37 و در مجاورت پنجره ها بر روی میز کار هورمون شناسی ممکن است بر روی پلیت رخ داده و منجر به ایجاد جذب های غیر یکنواخت در استریپ های شوک خورده و سایر استریپ می گردد(شوک سرمائی یا گرمائی) لذا قابل توصیه می باشد پلیت ها در عمق انکوباتور قرار داده شود و میز کار هورمون در مجاور پنجره یا سیستم های سرمایش و گرمایش نباشد .10- ایجاد حباب هوا در چاهک های پلیت مانع تماس کامل کنژوکه و سرم یا بروز جذب های غیر یکنواخت می گردد

اسلاید 171: منابع خطا شایع در روش انزیم ایمونو اسی 11- استفاده از پارافیلم یا کاور چسبنده مناسب در سطح پلیت در هر مرحله از انکوباسیون الزامی بوده و مانع تبخیر و حضور گرد و غبار در محیط حساس واکنش انزیمی می گردد . تبخیر معرف ها منجر به بروز افزایش کاذب جذب نوری می گردد .12- قرار دادن پلیت در تاریکی پس از اضافه نمودن سوبسترا و کروموژن الزامی است و مانع بروز واکنش جذب اضافی و کاذب می گردد 13- کنترل معرف های کیت الایزا قبل از مصرف الزامی است که شامل : الف) کنترل سلامت معرف سوبسترا و کروموژن با اختلاط حجم مساوی از کنژوکه و مخلوط سوبسترا و کروموژن در یک لوله نو جداگانه است که بایستی با تغییر رنگ سریع به رنگ آبی همراه باشد ب) کنترل ماکروسکوپی معرف های کیت به لحاظ کودرت ناشی از الودگی قارچی یا باکتریال و یا حضور جسم خارجی در معرف ها الزامی است ج) ظهور رنگ ابی در محلول کروموژن بی رنگ قبل از واکنش نهائی نشانه الودگی کروموژن به مواد اکسیدان و غیر قابل مصرف بودن ان می باشد 14- تهیه محلول سوبسترا بیش از حد مورد نیاز و ماندن ان در محیط ازمایشگاه منجر به الودگی قارچی باکتریال معرف و بی اثر شدن معرف می گردد لذا محلول آماده به کار سوبسترا کروموژن بایستی حداکثر یک ساعت قبل از مصرف تهیه گردد و در تاریکی نگاه داری گردد .

اسلاید 172: منابع خطا شایع در روش انزیم ایمونو اسی 15- ممانعت از تماس مستقیم دست با محلول کروموژن که حاوی حلال متانول و دی متیل سولفوکساید می باشد که سمیت داشته و دارای جذب پوستی می باشد16- میکس کردن ارام و زماندار کالیبراتور ها و نمونه ها قبل از شروع کار الزامی است 17- با توجه به تغییر شرایط محیطی و پرسنلی در هر ردیف کاری استفاده از کالیبراتور ها در هر ردیف کاری الزامی است و استفاده از منحنی ذخیره شده در دستگاه صرفا جهت موارد ضروری و در صورت عدم دسترسی به کالیبراتورهای کیت قابل توجیه می باشد . استفاده از منحنی ذخیره کالیبراسیون از مهمترین منابع خطا های سیستماتیک در روش های ایمونو اسی می باشد .18- جابجائی لیبل ها در کالیبراتور در هنگام مونتاژ کیت ها امکان پذیر بوده و از علل مشاهده منحنی های غیر معتبر می باشد .19- در بوروشور کیت ها توصیه می گردد در اولین ردیف کاری استاندارد ها ( کالیبراتور ها) دوپلیکیت ( مضاعف) گذاشته شود تا ضریب دقت و صحت منحنی حاصل بالا برود20- در صورت عدم همخوانی کانال های سمپلر مولتی کانال ( 8 کاناله) یا رسوب نمک در یکی از شاخه های سمپلرمولتی کانال یا واشر احتمال بروز جذب های غیر یکنواخت در نمونه ها و استاندارد های مضاعف وجود دارد

اسلاید 173: منابع خطا شایع در روش انزیم ایمونواسی soaking Time21- زمان خیس خوردن : زمان خیس خوردن در فواصل شستشو بایست حداقل 20 و حداکثر 40 ثانیه باشد تا منجر به دفع اتصالات غیر اختصاصی از مجاور اتصالات اختصاصی گردد .22- عدم تکان دادن پلیت( حداقل 20 ثانیه) پس از اضافه نمودن محلول اسیدی توقف دهنده واکنش منجر به عدم اختلاط کامل اسید با معرف ها و عدم توقف کامل واکنش انزیمی و در نهایت پیشرفت واکنش انزیمی در پایان کار و تغییرجذب نمونه ها و استاندارد ها و شیب منحنی کالیبراسیون در زمان های مختلف می گردد23- با توجه به اینکه مسیر خوانش و عبور نور در میکرو پلیت الایزا از بالا به پایین است پاک نکردن کف پلیت قبل از خوانش نهائی با الایزاریدر منجر به ظهور جذب های غیر یکنواخت می گردد خصوصا الودگی کف پلیت به چربی سطحی پوست دست یا بافر سرریز شده و خشک شده یا الودگی سطح میز کار24- فاکتور روماتوئیدی مثبت در بیمار منجر به بروز نتیجه مثبت کاذب در تست های الایزا میگردد لذا گرفتن شرح حال و انجام یک تست روماتویید فاکتور در افراد مشکوک کمک کننده می باشد .

اسلاید 174: منابع خطا شایع در روش انزیم ایمونواسی Well to well contamination25- آلودگی چاهک به چاهک : ناشی از سرعت بالای تخلیه یا تخلیه عمودی محلول به داخل میکرو پلیت می باشد یا به دلیل پرکردن بیش از حد بافر داخل چاهک ها می باشد . تکنیک صحیح تخلیه به طور مایل و چسبیده به جدار جانبی و فوقانی چاهک می باشد . جهت جلوگیری الودگی چاهک به چاهک در تست های کیفی یا کمی توصیه می گردد کنترل منفی ابتدا ریخته شود و سپش کنترل مثبت ریخته شود در ضمن تست مجاور کنترل مثبت به طور مضاعف و در انتهای پلیت مجددا ریخته شود . Hook effect26- اثر قلابی یا تله ای : همان پدیده پروزون در واکنش های ایمونواسی می باشد که به دلیل غلظت بسیار بالا انتی ژن بروز کرده و منجر به بروز جواب های منفی کاذب ( بینابینی ) می گرد د خصوصا در تست های کمی بتا ساب یونیت / فریتین / الفا فتو /TSH - PSA/-CA 125-پروتئیناثر قلابی یا تله ای به دلیل پرشدن کلیه انتی ژن بایندینگ سایت ها ی کنژوکه توسط انتی ژن های فراوان موجود در محیط می باشد که به عبارتی با نوترالیزه کردن انتی ژن مانع تماس انتی ژن با انتی بادی کف پلیت می گردد. راه پیشگیری از اثر قلابی در کیت های الایزا : 1- اضافه نمودن یک مرحله شستشو قبل از افزودن آنتی بادی نهائی ( ثانویه) 2- استفاده اولیه از رقت مناسب برای نمونه های سرم با استفاده از رقیق کننده خود کیت و در صورت عدم دسترسی استفاده از سرم افراد نرمال

اسلاید 175: منابع خطا شایع در روش انزیم ایمونواسی high back ground noise 26- جذب زمینه ای بالا پلیت : زمانی که جذب بافر فسفات در چاهک ( به تنهائی) بیش از 0.1 باشد ( بایستی کمتر از 0.05 باشد) / در جذب زمینه ای بالا می توان با اضافه کردن یک تا دو نوبت شستشو اضافی این اثر زمینه ای را ازبین برد / در صورتی که جذب کنترل منفی کیت بالا 0.2 باشد با مجاورت ان با سرم نرمال انسان( 1%) میتوان سایت های غیر اختصاصی را حذف و جذب نموده تا جواب های مناسب بدست اوریم 27 – تنظیم فیلتر دستگاه توسط فیلتر خاکستری ( گری فیلتر ) در سه طول موج پایین و متوسط و بالا توسط شرکت پشتیبان ( شش ماهه یا سالانه ) منجر به افزایش اعتماد به صحت طول موج های اندازه گیری در الایزا ریدر می گردد28- جهت کنترل تکرار پذیری فتومتر می توان از یک محلول رنگی یکنواخت و پایدار مثل دی کرومات پتاس در میکروپلیت استفاده نمود و دریافت جذب های یکنواخت نشانه سلامت سیستم نوری فتومتر است (در غیر این صورت جذب های غیر یکنواخت بدست می اید )

اسلاید 176: منابع خطا شایع در روش انزیم ایمونواسی رانش در سنجش :DRIFT29- رانش عبارت است از اختلاف غلظت حاصل از یک نمونه واحد در موقعیت های مختلف / یک پلیت در یک نوبت کاری / بهترین راه شناسائی رانش استفاده دوپلیکیت کنترل یا نمونه از قبل تعیین شده در ابتدا و انتهای پلیت در یک ردیف کاری می باشددلایل اصلی رانش در سنجش : 1-شایعترین علت دریفت یا رانش سنجش تعداد آزمایش بالا در یک ران یا ردیف کاری می باشد به نحوی که بین افزودن محلول ها فاصله زمانی طولانی وجود داشته باشد .2- ناهمگونی بین چاهک ها 3- عدم رعایت ترتیب در ریختن راژنت ها از ابتدا تا انتها پلیت 4- سرد بودن معرف ها در هنگام شروع به کار منجر به اختلاف دما اولین چاهک با آخرین چاهک و رانش در سنجش می گردد 5- مخلوط نشدن معرف ها در زمان ریختن به چاهک ها 6- واکنش کند و سریع محلول متوقف کننده نهائی جهت توقف نهائی واکنش

اسلاید 177: نحوه کاربرد صحیح نوک سمپلر و سمپلردر انزیم ایمونواسی 1- در صورت الزام به استفاده از نوک سمپلر مصرف شده نوک سمپلر بایستی اتوکلاو شده و بازبودن نوک تک تک نوک سمپلر ها چک شده باشد در ضمن نوک مصرف شده فاقد ماهیت نچسب بودن می باشد و در اثر اتوکلاو تغییر شکل و حجم می دهد 2- محکم نشدن نوک روی بدنه سمپلر منجر به ریزش نمونه یا معرف و بروز خطا می گردد 3- بد جا انداختن اورینگ سمپلر در هنگام نظافت و سرویس سمپلر منجر به ریزش مایع از نوک سمپلر وبروز خطا می گردد 4- تماس دست با نوک سمپلر و الودگی باکتریال ان می تواند منجر به الودگی محلول کنژوکه و تضعیف یا خنثی شدن معرف کنژوکه گردد. استاف و استرپتوکوک بواسطه رسپتور اف سی قادر به جذب غیر اختصاصی ایمونوگلوبین جی در محیط بوده و منجر به جذب انتی بادی کنژکه و تضعیف تیتر کنژوکه می گردد 5- چسبندگی ترکیبات پروتئینی سرم و پلاسما به سطح نوک سمپلر ( خصوصا البومین ) خصوصا زمانی که نوک را داخل لوله غوطه ور می نماییم منجر به تخلیه سرم اضافی و بروز خطا می گردد ( راه حل اساسی برداشت نمونه از سطح خارجی سرم و عدم غوطه ورکردن نوک در سرم یا پاک کردن متناوب نوک ها با گاز یا دستمال بدون پرز می باشد )6- کنترل روزانه یا هفتگی مخروط سمپلر به لحاظ الودگی به سرم یا معرف یا اسید 7- اشنائی به تکنیک برداشت معکوس نمونه در حجم های پایین سرم 8- کنترل کیفی وزنی سمپلر های کمتر از 200 لاندا ( سه تا شش ماه یک بار به طور منظم) و کنترل صحت و دقت مجاز هر سمپلر ( بایاس کمتر از 3% و ضریب تغییرات کمتر از 5%) 9- نوک را حتی الامکان تا حد صحیح در نمونه پائین ببرید ( 2 تا 5 میلی متر پائین تر از تقعر سطح نمونه در لوله) 10- نوک سمپلر نبایستی با ته چاهک تماس یابد و نبایستی از بالا به داخل چاهک چکانده شود

اسلاید 178: نکات مهم در آماده سازی نمونه های ایمونو اسی1- سرم های بیمارانی که غلظت بالائی از ایمونوگلوبولین و پروتئین های اختصاصی و آنزیم ها را دارا می باشد دچار تغییر ماتریکس شده و نتایج نادرست نشان خواهد داد لذا رقیق نمودن این نمونه ها با یک رقیق کننده مناسب منجر به تعدیل ماتریکس و ارائه جواب های صحیح می گردد. از برخی رقیق کننده های مناسب میتوان نام برد : استاندارد صفر / محلول بافرسنجش حاوی پروتئین / سرم عاری از هورمون و آنالیت / پولد سرم با غلظت پائین2- تقریبا در تمام سنجش های ایمنی نمونه اصلی سرم می باشد و درصورت استفاده از پلاسما بایستی الزاما با دقت بروشور کیت خوانده شود و در صورت بلامانع بودن کاربرد پلاسما از نمونه پلاسما استفاده گردد در ضمن نوع ضد انعقاد نیز مهم است به عنوان مثال در روش های انزیم ایمونو اسی که آنزیم آلکالن فسفاتاز به عنوان آنزیم نشاندار کاربرد دارد استفاده از ضد انعقاد سیترات و اتیلن دی آمین تترا استیک اسید ممنوع است که هر دوشلاتور قوی یون های فلزی و مهار کننده آنزیم آلکالن فسفاتاز / می باشد / 3- پاراپروتئینمی منجر به افزایش ویسکوزیته سرم و کاهش برداشت سرم و نهایتا جواب های با کاهش کاذب می گردد4- در سنجش های انزیم ایمونو اسی که نشانگر آنزیمی آن پراکسیداز است مطلقا نبایستی از نمونه حاوی سدیم آزاید استفاده نمود 5- همولیز نمونه منجر به افزایش کاذب جذب نوری در روش ایمونو اسی می گردد ( خصوصا در اندازه گیری تیروکسین آزاد که منجر به کاهش کاذب می گردد)

اسلاید 179: نکات مهم در مراحل شستشو چاهک ها با بافر1- محلول های شستشو عمدتا حاوی دترژنت می باشند که منجر به تولید حباب یا کف در حین ساخت محلول کار بافر می گردد لذا بایستی مراقب بود در زمان شستشو این حباب یا کف ها وارد چاهک ها نشوند که منجر به کاهش سطح تماس بافر با چاهک ها و کاهش اثر شستشو می گردند 2- اندازه گیری پ هاش بافر شستشو نهائی ( محلول کار بافر ) از کارهای اصولی است که بهتر است انجام گردد . به عنان مثال در بافر فسفات پ هاش ایده آل 7.2 است و شرایط اسیدی یا قلیائی منجر به ظهور جذب نوری کاذب بالا یا پائین می گردد . جهت این کار تحت کنترل بودن پ هاش آب مقطر مورد نیاز جهت تهیه بافر الزامی است 3- تاریخ تهیه بافر روی ظرف بافر قید شود و محلول بافر تازه به تازه و به میزان نیاز تهیه گردد 4- در واشر های اتوماتیک بایستی سرعت ریختن بافر و آسپیراسیون بافر به شکلی تنظیم گردد تا زمان خیس خوردن پلیت به طور کامل رعایت گردد . 5- تهیه بافر غلیظ یا رقیق خارج از رنج رقت بروشور منجر به کاهش یا افزایش قدرت بافر و نهایتا سیگنال مثبت یا منفی کاذب در روش می گردد به عنوال مثال بافر که بیش از حد رقیق شده باشد قادر به جداسازی اتصالات غیر اختصاصی از محیط چاهک نبوده و سیگنال مثبت کاذب حاصل می نماید و برای بافر غلیظ عکس این موضوع صدق می نماید

اسلاید 180: نقش تکان دادن (شیکینگ ) پلیت درسرعت واکنش ایمونو اسی زمانی که پلیت الیزا شیک می گردد انرژی کافی برای انتقال ملکول آنالیت به فاز جامد فراهم می شود و انتشار کمتر اهمیت می یابد به طور کلی شیک 1200 دور در دقیقه به مدت یک ساعت واکنش را به تعادل می رساند که همین سیستم در مدت زمان 16 الی 32 ساعت بدون شیک به تعادل خواهد رسیدمخلوط کردن کافی و مناسب معرف ها زمان انکوباسیون را کوتاهتر می نماید ( انکوباسیون طولانی هم حساسیت و هم ویژگی سنجش را در روش های غیر رقابتی ایمونو اسی افزایش می دهد خصوصا در تست هائی که حساسیت یک جز ضروری است رعایت دقیق زمان انکوباسیون الزامی است نظیر TSH&Hbs Ag

اسلاید 181: شاخص های پایداری معرف های الایزا موارد نقص پایداری فیزیکی معرف شامل : تغییر رنگ یا بیرنگ شدن معرف و رسوب گذاری معرفموارد نقص پایداری باکتریواستاتیک معرف : غلظت نامناسب و نوع نامناسب مواد ضد باکتری در معرف ها منجر به رشد باکتری در معرف ها و آلودگی معرف می گرددموارد نقص پایداری شیمیائی معرف ها : کاهش تمایل اتصال به دلیل تخریب آنتی بادی یا آنزیم موجود در کنژوکه یا تغییر رنگ معرف کروموژن به دلیل هیدرولیز یا اکسیداسیون یا احیا

اسلاید 182: تعیین شاخص های عملکردی کیت های الایزا حساسیت تشخیصی / ویژگی تشخیصی Diagnostic sensivity / Diagnostic SpecifityDiagnostic sensivity حساسیت تشخیصی شامل تعداد افراد دارای بیماری است که دارای آزمایش مثبت می باشند و و ارزش اصلی حساسیت تشخیصی شناساندن افراد بیمار که آزمایش منفی دارند (گروه منفی کاذب ) می باشدDiagnostic Specifityویژگی تشخیصی ویژگی تشخیصی شامل تعداد افراد غیر بیمار است که آزمایش منفی دارند و و ارزش اصلی ویژگی تشخیصی تعیین افراد غیر بیمار که نتیجه آزمایش مثبت دارند ( گروه مثبت کاذب ) می باشدروش اندازه گیری ویژگی تشخیصی و حساسیت تشخیصی در کیت های الایزا : 1- اندازه گیری بر روی تعداد زیادی نمونه سرم کنترل مثبت و منفی ( یا سرم رفرانس) 2- جداسازی افراد بیمار از غیر بیمار با روش های استاندارد و مرجع 3- مقایسه دو روش اندازه گیری معمول و روش مرجع و محاسبه آماری شاخص ها

اسلاید 183: تعیین شاخص های عملکردی کیت های الایزا حساسیت آنالیتیکال / ویژگی آنالیتیکال Analytical sensivity / Analytical Specifity:Analytical sensivity حساسیت آنالیتیکال حساسیت آنالیتیکال یا سنجش شامل کمترین مقدار قابل اندازه گیری یک آنالیت با تکرار پذیری قابل قبول و قابل گزارش می باشد روش تعیین حساسیت آنالیتیکال استفاده از طریق روش آنالیز آخرین تیتر رقت قابل شناسائی می باشد در این روش یک کالیبراتور با غلظت پائین را به شکل سریال دایلوشن رقیق نموده و آخرین تیتر که در آن آنالیت قابل شناسائی باشد تحت عنوان حساسیت آنالیتیکال نامیده می شود :Analytical Specifityویژگی آنالیتیکال ویژگی آنالیتیکال به معنای عدم ایجاد واکنش متقاطع با سایر آنالیت های مرتبط را شامل می شود. روش اندازه گیری ویژگی آنالیتیکال : کاربرد پانل سرم هائی حاوی آنالیت های مشابه یا آنتی بادی های مشابه که احتمال واکنش متقاطع در آن وجود دارد

اسلاید 184: Serology QCAffinityقدرت اتصال بین یک اپی توپ یک آنتی ژن با یک جایگاه اتصال انتی بادی را گویند افینیتی یک ثابت تعادلی است که قدرت واکنش بین یک سایت اپی توپ آنتی ژن ویک سایت گیرنده انتی بادی را توصیف می نماید Avidityاویدیتی یه طور کلی و مجموع قدرت سایت های آنتی ژنیک یک آنتی ژن را در اتصال به مجموع سایت های یک آنتی بادی را بیان می کند قدرت و نماد عددی اویدیتی همواره از مجموع عددی افینیتی بالاتر است

اسلاید 185: Acquiring Positive and Negative SeraNegative serum samples may come from specific pathogenfree (SPF) animals, if they exist, or from animals that have repeatedly tested negative by other tests or laboratories.Positive serum samples are frequently the most difficult to accumulate in large enough numbers for assay development. Ideally, they should come from natural infections that are confirmed by other diagnostic techniques and should represent a wide range of time points after infection

اسلاید 186: Acquiring Positive and Negative SeraFor assay development, control sera should be accumulated and pooled, when necessary, to achieve volumes of several milliliters for each sample, which should then be placed in single-use aliquots (e.g., 0.1 ml) and frozen at –70ºC until use. Representative aliquots of frozen sera should be qualified by comparison to existing assays or by outside laboratories, where appropriate, and the results recorded in the serum lot documentation records. Known positive and negative serum samples for assay prevalidation and validation must also be accumulated and aliquoted in a similar manner.

اسلاید 187: نکات تهیه رقت در سرولوژی رقت های مختلف سرم با با ترکیب یک نسبت معین سرم با ماده رقیق کننده بدست می آید که ساده ترین مسیر آن تهیه رقت سریالی است در تهیه رقت سریالی تهیه رقت اول مناسب و اوت کردن حجم ثابت از مخلوط در رقت اخر نکات کلیدی کار می باشد که در تهیه رقت سرم در تست رایت و ویدال و سی آر پی و روماتوئید فاکتور و.. کاربرد روتین دارد.بهترین ماده رقیق کننده در سرولوژی نرمال سالین است به عنوان مثال جهت تهیه یک رقت 1 به 8 بایستی یک بخش سرم را با 7 بخش نرمال سالین مخلوط نمائیم

اسلاید 188: Seroconversion سرو کانورشنایجاد و توسعه آنتی بادی اختصاصی قابل تشخیص بر علیه یک میکرو ارگانیسم در سرم خون را سرو کانورشن گویند که به دلیل ایمونیزه شدن ان فرد بر علیه ان میکرو ارگانیسم می باشد

اسلاید 189: Testing paired Samples  Testing paired Samples Testing for infectious diseases is performed on acute and convalescent specimens (about 2 weeks apart) Paired sample. Must see 4-fold or 2-tube rise in titre to be clinically significant  

اسلاید 190: Sero reversion  Sero reversion is the opposite of seroconversion. This is when the tests can no longer detect antibodies or antigens in a patient’s serum  

اسلاید 191: Antigen and Antibody reactions can be identified by different methods  

اسلاید 192: PrecipitationPrecipitation Principle Soluble antigen + antibody (in proper proportions) –> visible precipitate Lattice formation (antigen binds with Fab sites of 2 antibodies) Examples Double diffusion (Ouchterlony) Single diffusion (radial immunodiffusion) Imunoelectrphoresis Immunofixation

اسلاید 193: Neutralization reactionsNeutralization reactions Similar in principle and interpretation of results Antibody-binding Hemagglutination inhibition (serum antibody reacts with known nonparticulate antigen –> binding occurs) Neutralization (antibody neutralizes toxin) After binding, antibody is not available to react in indicator system Results: NO agglutination or NO hemolysis = positive reaction Agglutination or hemolysis = negative reaction (antibody not bound in origin  

اسلاید 194: Neutralization reactions : Generally, positive control samples used in inhibition or neutralization tests show no reaction and negative control samples show a reaction (opposite of results in direct agglutination testing) Example of inhibition: Hemagglutination inhibition test for rubella Example of neutralization: antistreptolysin O test (ASO) Neutralization reactions  

اسلاید 195: Complement fixation (CF) Complement fixation (CF) Antibody and antigen allowed to combine in presence of complement If complement is fixed by specific antigen-antibody reaction, it will be unable to combine with indicator system Precautions Serum must be heat-activated Stored serum becomes anti-complementary Extensive QC/standardization required Only use for IgM antibodies

اسلاید 196: Imunoelectrphoresis (IEP)Qualitative Imunoelectrphoresis (IEP)Qualitative A serum sample is electrophoresed through an agar mediumA trough is cut in the agar and filled with Ab. A precipitin arc is then formed. Because Ag diffuses radially and Ab from a trough diffuses, the reactants meet in optimal proportions for precipitation

اسلاید 197: NephelometryNephelometry Procedure Serum substance reacts with specific antisera and forms insoluble complexes Light is passed through suspension Scattered (reflected) light is proportional to number of insoluble complexes; compare to standards Examples Complement component concentration Antibody concentration (IgG, IgM, IgA, etc.) Immunofluorescence

اسلاید 198: ImmunofluorescenceImmunofluorescence Direct – add fluorescein-labeled antibody to patient tissue, wash, and examine under fluorescent microscope Indirect – add patient serum to tissue containing known antigen, wash, add labeled antiglobulin, wash, and examine under fluorescent microscope Examples Testing for Antinuclear Antibodies (ANA) Fluorescent Treponemal Antibody Test (FTA-Abs)

اسلاید 199: Agglutination  Agglutination Principle Particulate antigen + antibody –> clumping Lattice formation (antigen binds with Fab sites of 2 antibodies forming bridges between antigens) Examples Direct agglutination (Blood Bank) Passive Hemagglutination (treat RBCs with tannic acid to allow adsorption of protein antigens) Passive latex agglutination (antigen attached to latex particle)

اسلاید 200: Flow cytometry Flow cytometry Method of choice for T- and B-cell analysis (lymphocyte phenotyping) Principle Incubate specimen with 1 or 2 monoclonal antibodies tagged with fluorochrome Single cells pass through incident light of instrument (laser) which excites fluorochrome and results in emitted light of different wavelength Intensity of fluorescence measured to detect cells possessing surface markers for the specific monoclonal antibodies that were employed Forward light scatter indicates cell size or volume 90° side-scattered light indicates granulation  

اسلاید 201: Common uses Flow cytometry  DNA analysis Reticulocyte counts Leukaemia/lymphoma classification CD 4 cell estimations in AIDS/HIV patients.

اسلاید 202: Widal test is century old ,Is it loosing importance ? Widal test is century old ,Is it loosing importance ? In this reaction antibodies react with antigens on the surface of particulate objects and cause the objects to clump together, or agglutinate. These reactions were the earliest to be adapted to diagnostic laboratory. Widal test is used for diagnosis of typhoid fever. This test, developed by Georges Fernand I. Widal (French physician) in 1896, is now supplemented by more sophisticated procedures.  

اسلاید 203: Causes Of False-positive Widal Agglutination Tests Causes Of False-positive Widal Agglutination Tests Previous immunization with Salmonella antigen. Cross-reaction with non – typhoidal Salmonella. Variability and poorly standardized commercial antigen preparation. Infection with malaria other Enterobacteriaceae charring the same s-LPS .

اسلاید 204: Causes of Negative Widal Agglutination Test : Causes of Negative Widal Agglutination Test The carrier state An inadequate inoculum of bacterial antigen in the host to induce antibody production Technical difficulty or errors in the performance of the testPrevious antibiotic treatment Variability in the preparation of commercial antigens. Declining importance of Widal test : Declining importance of Widal test The value of the salmonella agglutination tests has declined as the incidence of typhoid fever has decreased, at least in the developed world, the general use of vaccines has increased, and ever increasing -numbers of antigenically related serotypes of Salmonella have been recognised

اسلاید 205: Serology - Importance of repeated tests Serology - Importance of repeated tests Criteria for diagnosing Primary Infection 4 fold or more increase in titre of IgG or total antibody between acute and convalescent sera Presence of IgM Seroconversion A single high titre of IgG (or total antibody) - very unreliable Criteria for diagnosing Reinfection Four fold or more increase in titre of IgG or total antibody between acute and convalescent sera Absence or slight increase in IgM

اسلاید 206: با تشکر از توجه و حوصله شما