مقدمه و کاربردهای بیوتکنولوژی

مقدمه و کاربردهای بیوتکنولوژی

اسلاید 1: 1مقدمه و كاربردهاي بيوتكنولوژيحسن كربكنديدكتراي عمومي داروسازي (اصفهان، 1372)PhD بيوتكنولوژي (منچستر، 1382)korbekandi@pharm.mui.ac.irhttp://pharm.mui.ac.ir/~korbekandi

اسلاید 2: 2Biotechnology:Bio مربوط به زيست و موجودات زنده‏‏Technology : فن آوريBiotechnology : زيست فن آوري، فن آوري زيستيتعريف: بهره برداري تجاري از ارگانيسمها يا اجزاي آنها مانند آنزيمها

اسلاید 3: 3Multidisciplinary بودن بيوتكنولوژيتوجه: در بيوتكنولوژي مدرن، از زيست شناسي مولكولي كاربردي، استفاده زيادي مي شود، اما Applied Molecular Biology معادل بيوتكنولوژي نيست (Bains, 1998)Biological SciencesChemical SciencesEngineering SciencesBio-technologyBio-chemistryChemical EngineeringBio-engineering

اسلاید 4: 4تاريخچهتوليد ماست، پنير، سركه و مشروبات الكلي از 8000 سال پيش تاكنونامكان بهبود طعم، قوام و كيفيت نگهداري مواد غذايي در اثر فعاليت ميكروارگانيسمهااولين ماده شيميايي توليد شده بكمك بيوتكنولوژي: اتانولتبديل گلوكز به گليسرول (بجاي الكل) توسط مخمر آبجو بوسيله آلمانها در آغاز جنگ جهاني اول (1918-1914) توليد استون- بوتانول از قندها توسط Clostridium acetobutylicum بوسيله انگليسيها در جنگ جهاني اول توليد اسيد سيتريك از قندها توسط Aspergillus niger در سال 1923

اسلاید 5: 5تاريخچه، ادامهكشف پني سيلين حاصل ازPenicillium notatum و تخليص آن در سال 1940غربالگري پني سيليومها براي يافتن گونه هاي مولد مقدار بيشتري پني سيلين ويافتنchrysogenum Penicilliumايجاد موتاسيون دراين سويه بوسيله نيتروژن موستارد، UV و X-rayغربالگري متناوب موتانتهاي مولد پني سيلين بيشتر و موتاسيون مجددكشف استرپتومايسين حاصل از Streptomyces griseus در سال 1944  متداول شدن غربالگري گونه هاي جداشده از محيط بخصوص غربالگري از بين اكتينوميستها (مولد 90% از آنتي بيوتيكهاي فعلي)

اسلاید 6: 6تاريخچه، ادامهتوليد پروتئين تك ياخته (SCP) در دهه 1960كشت مقياس وسيع سلولهاي حيواني در دهه 1960براي توليد واكسنهاي ويروسيتوليد سلولهاي Hybridoma از ادغام سلولهاي myeloma و رده خاصي از لنفوسيتهاي طحال براي توليد Monoclonal Antibodies در دهه 1980 كشت سلولهاي گياهي براي توليد مواد شيميايي كشاورزي، دارويي، طعم دهنده و رنگيبيوتكنولوژي مدرن: انقلاب حاصل از تكنولوژي DNA نوتركيب در دهه 1980 و امكان توليد پروتئينهاي درماني از ميكروارگانيسمها، سلولهاي گياهي و حيواني

اسلاید 7: 7كاربردهاي كلي بيوتكنولوژي داروسازي و پزشكي صنايع (غذايي، شوينده، چرمسازي و نظامي ) كشاورزي دامپروري حفاظت محيط زيست

اسلاید 8: 8كاربردهاي بيوتكنولوژيك ميكروارگانيسمها1- توليد سلولهاي كامل يا توده زيستي (Biomass):مواد تلقيحي (Inoculants):حشره كشهاي ميكربي: Bacillus thuringiensis كشتهاي آغازكننده (Starter Cultures) براي تهيه لبنيات: Lactobacillus sp., Streptococcus cremoris پروتئين تك ياخته (SCP): Probioticsواكسنهاي باكتريايي2- توليد تركيبات با وزن مولكولي پايين:متابوليتهاي اوليهمحصولات نهايي متابوليك: اتانول، استون، بوتانول، اسيد لاكتيك متابوليتهاي اوليه اساسي: اسيدهاي آمينه، ويتامينها، نوكلئوزيدها متابوليتهاي ثانويه: آنتي بيوتيكها، مايكوتوكسينها، پيگمانها3- توليد تركيبات با وزن مولكولي بالا:پلي ساكاريدهاليپيدها پروتئينها (آنزيمها ، داروها ، فراورده هاي بيولوژيك)4- فرايندهاي وابسته به متابوليسم ميكروارگانيسمها: تغييروتبديلات بيولوژيك (Biotransformations): استروئيدها، اسيدهاي آمينه، سوربوزتجزيه/ اكسيداسيون فاضلابها و موايد زايد سمي استخراج مواد معدني

اسلاید 9: 9توليد Biomass، مواد تلقيحي (Inoculants)توليد مخمر نان و آبجو ((Saccharomyces cerevisiae بعنوان مايه تخمير تهيه نان، شيريني و مشروبات الكلي توليد ريزوبيومهاي همزيست براي گره سازي و تثبيت N دردانه هاي حبوبات و افزودن به خاك مناطق فاقد آنها مانند استرالياتوليد هاگهاي Penicillium roquefortii و گونه هاي مربوطه بعنوان مايه براي پنيرهاي داراي رگه هاي آبي جهت ايجاد قوام وطعم ويژهتوليد Psedomonas syringae براي كاتاليزتشكيل هستك يخ و تشكيل برف مصنوعي در پيستهاي اسكي و يا جلوگيري از آسيب يخ به محصولات كشاورزي با استفاده از گونه هاي جهش يافته فاقد توانايي هسته زايي يخ

اسلاید 10: 10توليد Biomass، (SCP)ٍSingle Cell Proteinتعريف: سلولها يا پروتئينهاي استخراج شده MO و كشت داده شده در مقياس انبوه مورد استفاده درغذاي انسان يا حيواندارا بودن پروتئين زياد، چربي، كربوهيدرات، اسيدهاي نوكلئيك، ويتامينها و مواد معدنياما محدود بودن توانايي انسان در هضم اسيدهاي نوكلئيك نياز به فرآوري و بيشتر بعنوان غذاي داممواد خام مورد استفاده توليدSCP: CO2، متان، متانول، اتانول، قندها،هيدروكربنهاي نفت، ضايعات صنعتي و كشاورزيميكروارگانيسمهاي مورد استفاده توليد:SCP جلبكها، اكتينوميستها، ساير باكتريها، مخمرها، قارچهاي رشته اي، قارچهي عالي تر

اسلاید 11: 11مثالهاي SCP1- كشت مداوم Methylophilus methylotrophus برروي متانول و آمونياك در انگلستان با نام Pruteen® ، داراي80 % پروتئين خام و ويتامين زياد، 2 برابر مغذي تر از سويا اما غير اقتصادي2- كشت قارچ venenatum Fusarium با جزء اصلي Mycoprotein و نام Quorn™پروتئين زياد، فيبر، چربي كم ، بدون كلسترولبافت فيبري و مزه شبيه گوشت17 سال سابقه مصرف دردنيا، گران و بيشترين مصرف توسط گياهخواران

اسلاید 12: 121- متابوليتهاي اوليه، توليد در حين رشد (‏Trophophase) محصولات نهايي متابوليك: اتانول، استون، بوتانول، اسيد لاكتيك، 3و 2-بوتان دي ال، توليد در مقادير غير مورد نياز سلول متابوليتهاي اساسي: اسيدهاي آمينه ، ويتامينها ، نوكلئوزيدها ، توليد در مقادير مورد نياز سلول (در wild type) 2- متابوليتهاي ثانويه ، توليد پس از توقف رشد (Idiophase) : آنتي بيوتيكها، مايكوتوكسينها، پيگمانهاتركيبات با وزن مولكولي پايين

اسلاید 13: 13كينتيك توليد محصولات در رابطه با رشد سلولهاConcentrationTimeBiomassTrophophaseIdiophaseSubstratePrimary MetaboliteSecondary Metabolite

اسلاید 14: 14محصولات ميكربي با وزن مولكولي پايين

اسلاید 15: 15 محصولات سنتي صنايع تخمير: اتانول، استون، بوتانول، اسيد لاكتيكبي هوازي و مولد CO2پر فروشترين محصول بيوتكنولوژي: الكلتوجه به جنبه هاي اقتصادي صنايع شيميايي رقيبمحصولات نهايي متابوليك

اسلاید 16: 16تخمير Fermentation Frever: جوشان، CO2از نظر بيوشيمي: توليد انرژي كه مواد آلي= الكترون دهنده + الكترون گيرنده نهايياز نظر بيوتكنولوژي: توليد محصولات با كشت انبوه MOواژه جديد معادل: Bioprocess

اسلاید 17: 17SugarsNAD+NADH + H+Pyruvic acidAcetaldehydeNADH + H+NAD+Ethanol (Yeasts)NADH + H+NAD+Lactic acidLactic acid bacteriaAcetyl-CoAAcetoacetyl-CoAAcetone(Clostridium)NADH + H+NAD+Butyryl-CoANADH + H+NAD+Butanol (Clostridium)-Acetolactic acidAcetoinNADH + H+NAD+2,3-Butanediol(Klebsiella sp.)

اسلاید 18: 18متابوليتهاي اوليه اساسيضروري براي رشد توليد تنها به قدر نياز بيش توليدآنها بوسيله تغيير تنظيم متابوليك (Overproduction)

اسلاید 19: 19متابوليتهاي اوليه اساسي تجاري

اسلاید 20: 20روشهاي اصلي افزايش توليد متابوليتهاي اوليه بوسيله تنظيمهاي متابوليك1- وقفه مهار بازخوردي(Feedback Inhibition): وقفه مهار فعاليت آنزيم كليدي بوسيله محصولات نهايي2- وقفه سركوب (Repression):وقفه سركوب سنتز آنزيمهاي مسير متابوليك بوسيله محصولات نهايي3- حذف واكنشهاي بيوشيميايي رقيب4- تغيير نفوذ پذيري غشاي سيتوپلاسمي

اسلاید 21: 21AspartateAspartate semi-aldehydeHomoserine dehydrogenaseHomoserineMethionineMutation 3Cystathionine -synthaseThreonineMutation 1IsoleucineRepression of enzyme synthesisMutation 2FeedbackInhibition of enzyme activityمهندسي متابوليك بيوسنتز ترئونين براي overproduction آن

اسلاید 22: 22مراحل تنظيم متابوليك Overproduction ترئونين1- تهيه موتانت غيرحساس به مهار بازخوردي ترئونين بر روي dehydrogenase Homoserine 2- تهيه موتانت فاقد قابليت تبديل ترئونين به ايزولوسينالف- تجمع ترئونين در اثر عدم تبديلب- عدم سركوب سنتز آنزيم مبدل هوموسرين به ترئونين در اثر كاهش ايزولوسين 3- تهيه موتانت فاقد قابليت تبديل هوموسرين به متيونين

اسلاید 23: 23مكانيسمهاي مراحل تنظيم متابوليك Overproduction ترئونين1- موتاسيون اول:ايجاد موتاسيونافزودن آنالوگ ترئونين (amino,-hydroxy valerate-)يافتن موتانتهاي مقاوم به اثر مهار رشد اين آنالوگ به روش Gradiant Plate 2- موتاسيون دوم:ايجاد موتاسيون يافتن موتانتهايي كه فقط در صورت تغذيه با ايزولوسين رشد مي كنند (Isoleucine Auxotrophs)3- موتاسيون سوم:ايجاد موتاسيون يافتن Methionine Auxotrophs

اسلاید 24: 24Gradient Plate Technique=آگار + آنالوگ10 ml=آگار 10 mlافزودن MOمنطقه رشدموتانتهاي مقاوم به آنالوگ

اسلاید 25: 25تغيير نفوذ پذيري غشاامكان خروج محصول از سلول  كاهش Feedback Inhibition و Repression مثال: افزايش توليد گلوتامات درCorynebacterium glutamicum با كاهش دادن بيوتين مهار سنتز اسيدهاي چرب غشايكپارچگي غشا↓نفوذپذيري غشا به گلوتامات↑ كاهش Feedback

اسلاید 26: 26 برخي از روشهاي انجام تنظيم متابوليك تكنيكهاي متداول ژنتيك و DNA نوتركيب روش اول: Cloning ژن آنزيمها، بخصوص آنزيمهاي Rate Limiting ايجاد كپي هاي متعدد ژن افزايش مقدار آنزيمروش دوم: Clone ژنهاي كليه آنزيمهاي يك مسير بيوسنتز به گونه اي كه سنتز آنها تحت كنترل يك پيش برنده كاملا مشخص نظيرlac promoter باشد

اسلاید 27: 27متابوليتهاي ثانويه (Idiolites)توليد پس از توقف رشد (Idiophase)غير ضروري براي رشدنقش نامشخص، احتمالا مزيت اكولوژيك و بقامعروفترين: آنتي بيوتيكهاساير: مايكو توكسينها، آلكالوئيدهاي ارگو، سايكلوسپورين(فرونشاننده ايمني)، fumagillin (مهاركننده رگزايي) و ... بيش از2500 آنتي بيوتيك، اكثرا از آكتينوميستها

اسلاید 28: 28توليد توسط تعداد كمي از ميكروارگانيسمهاوابستگي شديد توليد آنها به شرايط محيطيگروهي بودن توليد متابوليتهاي با ساختمان مشابه توسط بعضي از ميكروارگانيسمها، مثال: توليد 32 آنتراسيكلين توسط يك نژاد استرپتومايسس متفاوت و متنوع بودن متابوليتهاي ثانويه توليدي توسط برخي از ميكروارگانيسمهاتفاوت قابل ملاحظه با متابوليتهاي اوليه در تنظيم بيوسنتز متابوليتهاي ثانويه، ادامه

اسلاید 29: 29افزايش توليد متابوليتهاي ثانويه1- Screening سويه هاي مولد مقدار بيشتر(40-30% تاثير روي نتيجه نهايي) بخصوص از محيطهاي نامتعارف: ارتفاعات ، مناطق سرد، آب دريا، بيابان، چشمه آب گرم ، زمينهاي نفت خيز2- ايجاد موتاسيون و انتخاب موتانتها بخصوص در جهت حذف كنترلهاي تنظيمي3- كلون ژنها، بخصوص ژنهاي كنترل كننده كل مسير بيوسنتز4- افزودن پيشتازها و اسيدامينه هاي محرك مثال:افزودن -aminoadipate  پني سيلين↑

اسلاید 30: 30افزايش توليد متابوليتهاي ثانويه، ادامه5- بيوسنتز هدايت شده: افزودن پيشتاز  هدايت مسير به توليد يك محصولمثال: افزودن فنيل استيك اسيد  بنزيل پني سيلين↑ در مقابل ساير پني سيلينها

اسلاید 31: 31موانع بيش توليد متابوليتهاي ثانويهعدم شناخت مسير بيوسنتز (اغلب)  دشواري موتاسيون انتخابيعدم شناخت كنترلهاي تنظيمي استفاده از فن آوري DNA نوتركيبتعيين توالي DNA تشخيص تعداد ژنهاي دخيل و مراحل بيوسنتز

اسلاید 32: 32توليد تركيبات با وزن مولكولي زياد پروتئينها پلي ساكاريدها ليپيدها

اسلاید 33: 33توليد پروتئينها آنزيمهاي Bulk ، توضيح مشروح بعداپروتئينهاي با ارزش درماني فن آوري DNA نوتركيب  افزايش توليد پروتئينها  كاهش هزينه ها وسختي جداسازي

اسلاید 34: 34توليد پروتئينهاي درمانيهورمون رشد گاوي  افزايش توليد شير گاو و سرعت رشد ماهيموفقيت آميزترين جنبه DNA نوتركيب: تهيه MO سنتز كننده پروتئينهاي درماني انسانيمقادير بسيار اندك پروتئينهاي درماني بخصوص هورمونها در بدنعدم تخليص يا حتي جداسازي بسياري از آنها قبل از پيدايش دستكاري ژنها

اسلاید 35: 35برخي پروتئينهاي درماني

اسلاید 36: 36پروتئينهاي درماني، ادامه

اسلاید 37: 37پروتئينهاي درمانيبسياري از پروتئينهاي درماني: گليكوپروتئينعدم يا تفاوت glycosylation در ميكروبها آنالوگهايي با فعاليت، توزيع، نيمه عمر و ايمني زايي متفاوتاتصال كووالان glycol Monomethoxy polyethylen به پروتئينها افزايش نيمه عمر ، اما هنوز آنالوگ توليد نسل دوم آنالوگها بوسيله مهندسي پروتئين

اسلاید 38: 38 مشكلات توليد پروتئينهاي درمانيزده شدن انتهاي پروتئينهاي خارجي بوسيله پروتئاز MO حداقل در E. coli جداسازي تكه ها براي پيشگيري از واكنش ايمنيتبديل پروتئينهاي خارجي به اجسام انباشته (inclusion bodies) غيرفعال، بازيابي بسيار مشكلتسهيل ساخت و چين دادن برخي از پروتئينها بوسيله ملازم (Chaperon) هاي مولكولي (يك نوع پروتئين)

اسلاید 39: 39 يك نمونه اصلي ملازم: پروتئين GroEL E. coli ، تسهيل چين خوردن پروتئينهاي خاص بدون شركت در ساختمان نهايييك كاربرد نسبتا جديد پروتئينهاي كلون شده:كلونينگ گيرنده هاي آدرنرژيك انسان در E. coli حفظ خواص اتصالي گيرنده ها در بافتهاي پستانداران استفاده آسانتر در مطالعات فارماكولوژيك غربالگري سريع داروهاي جديد

اسلاید 40: 40ويژگيهاي پروتئينهاي درماني تزريقيخلوص <95%ناهمگني> حد مجازDNA آلاينده> 10 pg/doseآندوتوكسين > حد مجازمواد سمي (هنگام تخليص)> حد مجازفعاليت ويژه < Min مجازغياب MO

اسلاید 41: 41Glycosylation پروتئينهاافزوده شدن كربوهيدراتها بعد از ترجمه (post-translational)به پروتئينهاي ترشح شده يا وابسته به سطح در ارگانيسمهاي عالي ترتغيير در خواص فيزيكوشيمياييو فيزيولوژيك: فعاليت، توزيع، ايمني زايي و نيمه عمر

اسلاید 42: 42Glycosilation

اسلاید 43: 43پلي ساكاريدهاي ميكربيمزاياي پلي ساكاريدهاي ميكروارگانيسمها: تامين يكنواخت و قابل اتكاخواص فيزيكوشيميايي نسبتا ثابت تجمع پلي ساكاريدها بيرون ديوارهexcess C،limiting  Nافزايش سنتزBatch و ContinuousChemostat : يكنواختsugars N limiting neutralacid sugars  Metal ions limitingتاثير ژنتيك كلاسيك در بيش توليد< recombinant DNA

اسلاید 44: 44پلي ساكاريدهاي ميكربي تجارتي

اسلاید 45: 45Polyhydroxyalkanoates (PHAs)بسياري باكتريهاذخيره داخل سلوليمشهورترين: poly(3-hydroxybutyrate):PHB 20 سال، Biodegradable thermoplasticاخيرا PHAs بهتر1990: ظرف شامپو Biodegradable كوپليمرگران  Cloningتجهيزات پزشكيحاملهاي دارويي