نگهداری و استفاده از سویه های باکتریایی

نگهداری و استفاده از سویه های باکتریایی

اسلاید 1: نگهداری واستفاده از سویه های باکتریایینگهداری طولانی مدتنگهداری کوتاه مدت

اسلاید 2: ۱- نگهداري در ديپ فريزر و یا نیتروژن مایع)حاوي ۵% خونTSAکشت باکتري مورد نظر روي محيط مغذيگوسفند و در مورد ميکروارگانيسمهاي سخت رشد روي محيط شکلات آگارپليتها را به مدت ۲۴- ۱۸ ساعت در دماي 2± 35 درجه سانتيگراد و در صورت نياز تحت شرايط CO2براي هر باکتري انکوبه نمائيد.سپس از باکتري رشد يافته ، سوسپانسيون غليظي درmL100 _50در محيط محافظ كننده از سرما تهيه نمائيدنگهداری طولانی مدت

اسلاید 3: محيط محافظت کننده از سرما ميتواند خون گوسفند يا خرگوش دفيبرينه ، Skim milk- Tryptic Soy Broth (TSB) حاوي گليسرول استريل با غلظت نهايي ۱۵ _۱۰ % باشدسپس از سوسپانسيون باکتريايي فوق به مقدار 0.5_1mlدر ويالهاي شيشهاي يا پلاستيکي کوچک استريل توزيع کنيد . تعداد ويال ذخيره خود را براي مصرف يکسال آماده نمائيد. سويه ها را ميتوان در برودت ۵۰ - تا ۷۰ - درجه سانتيگراد به مدت يکسال نگهداري نمود در صورت عدم دسترسي به فريزر ۷۰ – درجهمي توان سويه هاي با رشد سريع را در فريزر ۲۰ - درجه نيز نگهداري نمود.

اسلاید 4: :در اين شرايط توجه به نکات زير ضروري استسويه هاي سخت رشد مانند هموفيلوس انفلوآنزا و نيسريا گنوره در اين دماقابل نگهداری نمی باشند و باید در 70- نگهداری شوند

اسلاید 5: سويه هاي بارشد سريع در اين دما عمر کمي دارند و تعداد زيادتري از آنها از بين ميروند. بنابراين توصيه يشود براي اطمينان از حيات سويه ها هر چند ماه ، طبق روش زير کشت داده شوند.

اسلاید 6: working controlعبارتست ازکشت مجدد از کشت ذخيره فريز شده که براي کنترل کيفيت کشتهاي محيط كشت و... استفاده مي شود.یک ویال را از فریزر خارج کرده و بلا فاصله زیر شیر آب ولرم محتويات آنرا ذوب نمائيد. نمونه را روي محيط آگار خوندار يا شکلاته ( در مورد باکتريهاي سخت رشد) تلقيح کرده و به مدت ۲۴انکوبه نماييد. ودر صورت نياز در شرايط 2 Coقرار میدهیم.

اسلاید 7: براي تهيه وركينگ كنترل از کشت ذخيره فريز شده ، روي پليت يا آگار شيبدار تلقيح و آنرا به مدت يک شبانه روز تا زماني که رشد مناسبي بدست آيد، انکوبه نمائيد. در مورد ارگانيسم هاي با رشد سريع اين پليت ياآگار شيبدار را مي توان در 8-2 درجه سانتيگراد يا در دماي اتاق تا مدت ۴ هفته نگهداري نمود بعد از هر پاساژخالص بودن و مورفولوژي کلنيها را بررسي نمائيد

اسلاید 8: از کشت ذخيره تا ۳ پاساژ پشت سر هم ميتوان انجام داد . پس از آن ، نمونه بايد دور انداخته شده واز يك وركينگ كنترل استفاده شود.پاساژهاي مکرر( بيش از ۳ پاساژ)، احتمال تغيير فنوتيپي سويه ها را افزايش ميدهد

اسلاید 9: استفاده از روغن معدني در دماي اتاق Brain Heart Infusion Agar (BHIA) ۱- محيط کشتباکتريهاي مشکل پسند مانند گونوکک ، مننگوکک ، استرپتوکک پنومونيه و هموفيلوس آنفلوانزا . شکلات آگار را با افزودن ۵% خون گوسفند به محيط فوق پس از خروج از اتوکلاو و رسيدن به دمای ۵۰ درجهسانتیگراد و قرار دادن در بن ماري ۸۰ درجه سانتيگراد به مدت ۱۵ دقيقه تهيه نمود.۲- روغن معدني ( يا پارافين مايع ) را در حرارت خشک ( ۱۷۰ درجه سانتيگراد به مدت يکساعت ) استريل نماييد.۳- ميکروب مورد نظر را روي محيط کشت دهيد.۱ روي سطح محيط بريزيد. cc ۴- بعد از بدست آوردن کشت کافي ، روغن استريل را به مقدار۵- در صورت نياز به کشت مجدد ، نمونه از سطح آگار (زير روغن ) برداشته ميشود.ماه تجديد کشت نماييد.6-بعد از 12-6 ماه تجديد كشت نماييد.

اسلاید 10: نگهداري کوتاه مدتکشتهاي وركينگ كنترل که براي کارهاي روتين روزانه استفاده ميشوند ، به روشهاي زير تهيهميشوند:باکتريهاي با رشد سريعلوله ای درپیچ دار کشت دهید TSA سوش مورد نظر را در سطح محيط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو 2±35 درجه سانتيگراد انکوبه نماييد.پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداري کنيدوهر ماه کشت را تجديد نمائيد.

اسلاید 11: استرپتوككها1- سوش مورد نظر را در سطح آگار خوندار شيبدار( لولهاي درپيچدار) کشت دهيد. ۲- محيط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو 2±35 درجه سانتيگراد انکوبه نماييد.۳- پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداري کنيد. ( جهت استرپتوکک پنومونيه ، محيط را در دماياتاق نگهداري کنيد.)۴- هر ماه کشت را تجديد نمائيد.مننگو کک و هموفيلوس۱- سوش مورد نظر را در سطح محيط آگار شکلاته لوله اي يا پليت کشت دهيد.۲- محيط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو 2±35 درجه سانتيگراد انکوبه نماييد.۳- پس از رشد کامل، لوله را در حرارت اتاق نگهداري کنيد ۴- هر ۲ هفته کشت را تجديد نمائيد. گونوکک۱- سوش مورد نظر را در سطح محيط آگار شکلاته کشت دهيد.۲- محيط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو 2±35 درجه سانتيگراد انکوبه نماييد.۳- نمونه را در دماي ۳۵ درجه نگهداري نماييد.۴- هر ۲ روز يکبار کشت را تجديد نمائيد.