نگهداری و استفاده از سویه های باکتریایی

صفحه 1:
نگهدا ى 4 مه ‎cf‏ ‎Z‏ ‏باکتریا ‎ws. 8‏ نگهدا 2 ; نگهدا نگهداری کوتاه مدت نه 

صفحه 2:
نگهداری طولانی مدت (نگهداری در دیپ فریزر و یا نیتروژن مایع -۱ کشت باكتري مورد نظر 395 محیط مغذي5۸حاوي 9۵۵ خون گوسفند و در مورد ميكروارگانيسمهاي سخت رشد روي محيط شکلات آگار * پلیتها را به مدت ۲۴- ۱۸ ساعت در دماي 2+ 35 درجه سانتیگراد و در صورت نیا تحت شرایط :0براي هر باكتري انکوبه نمائید. * سپس از باكتري رشد یافته , سوسپانسیون غليظي در101,100 ‎eis =— §‏ << 2000 و 

صفحه 3:
— — * محیط محافظت کننده از سرما میتواند خون گوسفند یا Skim milk- Tryptic Soy Broth . ai u92 yu9S > 96 ۱۰ ۱۵ ‏حاوي گلیسرول استریل با غلظت نهايي‎ (TSB) باشد * سپس از سوسپانسیون باكتريايي فوق به مقدار 0.5 _1701در ويالهاي شيشهاي یا پلاستيكي کوچک استریل توزیع کنید . .بعداد ویال ذخیره خودررا براي مصرف یکسال آماده ‎ails‏ * سویه ها را میتوان در برودت ۵۰ - تا ۷۰ - درجه سانتیگراد به مدت یکسال نگهداري نمود در صورت عدم دسترسي به فریزر ۷۰ - درجه * مي توان سویه هاي با رشد سریع را در فریزر ۲۰ - درجه نیز ‎i‏ 

صفحه 4:
در لین‌شرلیط توجه به نکاتزیر ضروريلستب سویه هاي سخت رشد مانند هموفیلوس انفلوآنزا و نیسریا گنوره در اين دما قابل نگهداری نمی باشند و باید در 260- نگهداری شوند 

صفحه 5:
سویه هاي بارشد سریع در اين دما عمر کمي دارند و تعداد ,زيادتري از آنها از بين ميروند بنابراین توصیه یشود براي اطمینان از. حیات سویه ها هر چند .ماه » طبق روش زیر کشت داده شوند 

صفحه 6:
working control ‏بارتست ازکشت مجدد از کشت ذخیره فریز شده که براي‎ ‏.کنترل کیفیت كشتهاي محیط کشت و... استفاده مي شود‎ ‏یک ویال را از فریزر خارج کرده و بلا فاصله زیر شیر آب‎ ولرم محتویات آنرا ذوب نمائید. نمونه را روي محیط آگار خوندار یا شکلاته ( در مورد باكتريهاي سخت رشد) تلقیح کرده و به مدت ۲۴ انکوبه نمایید. ودر صورت نیاز در شرایط 6 م)فرار میدهیم. 

صفحه 7:
, ‏تهیه ورکینگ کنترل از کشت ذخیره فریز شده‎ sly ‏روي پلیت یا آگار شیبدار تلقیح و آنرا به مدت یک شبانه‎ ‏.روز تا زماني که رشد مناسبي بندست آید انکوبه نمائید‎ در مورد ارگانیسم هاي با رشد سریع این پلیت یاآگار شیبدار را مي توان در 2-8 درجه سانتیگراد یا در دماي اتاق تا مدت ۴ هفته نگهداري نمود بعد از هر پاساژخالص بودن و مورفولوژي کلنیها را بررسي نمائید 

صفحه 8:
از کشت ذخیره تا ۳ پاساژ پشت سر هم میتوان انجام داد . پس از آن , نمونه باید دور انداخته شده واز يك ورکینگ .کنترل استفاده شود پاساژهاي مکرر( بیش از ۲ پاساز), احتمال تغییر فنوتييي سویه ها را افزايش میدهد 

صفحه 9:
ار معدي د دماي اتاق ‎Brain Heart Infusion Agar (BHIA) \eus S loro‏ باكتريهاي مشکل پسند مانند گونوکک , مننگوکک » استریتوکک پنومونیه و . هموفیلوس آنفلوانزا شکلات آگار را با افزودن ۲۵۵ خون گوسفند به محیط فوق پس از خروح از اتوکلاو و رسیدن به دمای ۵۰ درجه سانتیگراد و قرار دادن در بن ماري ۸۰ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه :تهیه نمود روغن معدني ( با پارافین مایع ) را در حرارت خشک ( ۱۷۰ درجه سانتیگراد -۲ .به مدت یکساعت ) استریل نمایید .میکروب مورد نظر را روي محیط کشت دهید ۳ بعد از بدست آوردن کشت کافي , روغن -۴ 00 .روي سطح محیط بریزید ۱ استریل را به مقدار در صورت نیاز به کشت مجدد » نمونه از سطح آگار (زیر روغن ) برداشته -۵ میشود .ماه تجدید کشت نمایید .بعد از 6-12 مام تجدید کشت مایید» 

صفحه 10:
= نگهداري کوتاه مدت كشتهاي ورکینگ کنترل که براي كارهاي روتین روزانه استفاده میشوند , به روشهاي زیر تهیه باكتريهاي با رشد سریع سوش مورد 158۸ لوله ای درپیچ دار کشت دهید نظر را در سطح محیط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو 3522 درجه سانتیگراد انکوبه نمایید. يس از رشد کامل, لوله را در یخچال نگهداري کنید .وهر ماه کشت را تجدید نمائید 

صفحه 11:
نعو ‎See‏ نظر را در سطح آگار خوندار شیبدار( لولهایدرپیچدار) ۱ مجیط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو 35*2 درجه سانتیگراد انگوبه نمایید ۲۶ پس از رشد کامل, لوله را در یخچال نگهداري کنید. ( جهت استریتوکک ۳۰ پنومونیه , محیط را در دماي (اتاق نگهداري کنید هر ماه کشت را تجدید نمائید -۴ مننگو کک و هموفیلوس سوش مورد تظر را در شنطح مجیط آگان شکلانه لوله:اي با پلیت کشت 1۳ ,دهید ۲- محیط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو 352 درجه سانتیگراد انکوبه تمایید. پس از رشد کامل, لوله را در حرارت اتاق نگهداري کنید -۳ هر ۲ هفته کشت را تجدید نمائید -۴ گونوکک سوشآموزد نظر را در سطح مجیطظ آکاز شکلاته کشت دهید ۳[ مخیط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو 352-2 درجه ساتتیگراد انکویه تمایید :۲ .نمونه را در دماي ۳۵ درجه نگهداري نمایید ۳ هر ۲ روز یکبار کشت را تجدید نمائید ۴ 

نگهداری واستفاده از سویه های باکتریایی نگهداری طوالنی مدت نگهداری کوتاه مدت نگهداری طوالنی مدت )نگهداري در ديپ فريزر و یا نیتروژن مایع ۱- کشت باکتري مورد نظر روي محيط مغذيTSAحاوي %۵خون گوسفند و در مورد ميکروارگانيسمهاي سخت رشد روي محيط شکالت آگار • پليتها را به مدت ۱۸ -۲۴ساعت در دماي 35 ±2درجه سانتيگراد و در صورت نياز تحت شرايط CO2براي هر باکتري انکوبه نمائيد. • سپس از باکتري رشد يافته ،سوسپانسيون غليظي درmL100 • محيط محافظت کننده از سرما ميتواند خون گوسفند يا خرگوش دفيبرينه Skim milk- Tryptic Soy Broth ، ) (TSBحاوي گليسرول استريل با غلظت نهايي % ۱۰_ ۱۵ باشد • سپس از سوسپانسيون باکتريايي فوق به مقدار 1ml_0.5در ويالهاي شيشهاي يا پالستيکي کوچک استريل توزيع کنيد . .تعداد ويال ذخيره خود را براي مصرف يکسال آماده نمائيد • سويه ها را ميتوان در برودت - ۵۰تا - ۷۰درجه سانتيگراد به مدت يکسال نگهداري نمود در صورت عدم دسترسي به فريزر – ۷۰درجه • مي توان سويه هاي با رشد سريع را در فريزر - ۲۰درجه نيز است در اينش رايط ت وجه ب ه ن کاتزير ض روري : سويه هاي سخت رشد مانند هموفيلوس انفلوآنزا و نيسريا گنوره در اين دما قابل نگهداری نمی باشند و باید در -70نگهداری شوند سويه هاي بارشد سريع در اين دما عمر کمي دارند و تعداد .زيادتري از آنها از بين ميروند بنابراين توصيه يشود براي اطمينان از حيات سويه ها هر چند .ماه ،طبق روش زير کشت داده شوند working control عبارتست ازکشت مجدد از کشت ذخيره فريز شده که براي .کنترل کيفيت کشتهاي محيط كشت و ...استفاده مي شود یک ویال را از فریزر خارج کرده و بال فاصله زیر شیر آب ولرم محتويات آنرا ذوب نمائيد .نمونه را روي محيط آگار خوندار يا شکالته ( در مورد باکتريهاي سخت رشد) تلقيح کرده و به مدت ۲۴انکوبه نماييد .ودر صورت نياز در شرايط Co 2قرار میدهیم. براي تهيه وركينگ كنترل از کشت ذخيره فريز شده ، روي پليت يا آگار شيبدار تلقيح و آنرا به مدت يک شبانه .روز تا زماني که رشد مناسبي بدست آيد ،انکوبه نمائيد در مورد ارگانيسم هاي با رشد سريع اين پليت ياآگار شيبدار را مي توان در 2-8درجه سانتيگراد يا در دماي اتاق تا مدت ۴هفته نگهداري نمود بعد از هر پاساژخالص بودن و مورفولوژي کلنيها را بررسي نمائيد از کشت ذخيره تا ۳پاساژ پشت سر هم ميتوان انجام داد . پس از آن ،نمونه بايد دور انداخته شده واز يك وركينگ .كنترل استفاده شود پاساژهاي مکرر( بيش از ۳پاساژ) ،احتمال تغيير فنوتيپي سويه ها را افزايش ميدهد استفاده از روغن معدني در دماي اتاق م حيط ک شتBrain Heart Infusion Agar (BHIA) ۱- باکتريهاي مشکل پسند مانند گونوکک ،مننگوکک ،استرپتوکک پنومونيه و .هموفيلوس آنفلوانزا شکالت آگار را با افزودن %۵خون گوسفند به محيط فوق پس از خروج از اتوکالو و رسيدن به دمای ۵۰درجه سانتیگراد و قرار دادن در بن ماري ۸۰درجه سانتيگراد به مدت ۱۵دقيقه .تهيه نمود روغن معدني ( يا پارافين مايع ) را در حرارت خشک ( ۱۷۰درجه سانتيگراد ۲- .به مدت يکساعت ) استريل نماييد .ميکروب مورد نظر را روي محيط کشت دهيد ۳- بعد از بدست آوردن کشت کافي ،روغن . cc ۴-روي سطح محيط بريزيد ۱ استريل را به مقدار در صورت نياز به کشت مجدد ،نمونه از سطح آگار (زير روغن ) برداشته ۵- .ميشود .ماه تجديد کشت نماييد .ب ع د از 6-12م اه ت جديد ك شتن ماييد6- نگهداري کوتاه مدت کشتهاي وركينگ كنترل که براي کارهاي روتين روزانه استفاده ميشوند ،به روشهاي زير تهيه :ميشوند باکتريهاي با رشد سريع سوش مورد TSAلوله ای درپیچ دار کشت دهید نظر را در سطح محيط را بمدت ۲۴ساعت در اتو 35±2درجه سانتيگراد انکوبه نماييد. پس از رشد کامل ،لوله را در يخچال نگهداري کنيد .وهر ماه کشت را تجديد نمائيد استرپتوككها س وشمورد ن ظر را در س طح آگار خوندار ش يبدار( ل ولهايدرپيچدار) 1- .ک شتدهيد .محيط را بمدت ۲۴ساعت در اتو 35±2درجه سانتيگراد انکوبه نماييد ۲- پس از رشد کامل ،لوله را در يخچال نگهداري کنيد ( .جهت استرپتوکک ۳- پنومونيه ،محيط را در دماي ).اتاق نگهداري کنيد .هر ماه کشت را تجديد نمائيد ۴- مننگو کک و هموفيلوس سوش مورد نظر را در سطح محيط آگار شکالته لوله اي يا پليت کشت ۱- .دهيد -۲محيط را بمدت ۲۴ساعت در اتو 35±2درجه سانتيگراد انکوبه نماييد. پس از رشد کامل ،لوله را در حرارت اتاق نگهداري کنيد ۳- .هر ۲هفته کشت را تجديد نمائيد ۴- گونوکک .سوش مورد نظر را در سطح محيط آگار شکالته کشت دهيد ۱- .محيط را بمدت ۲۴ساعت در اتو 35±2درجه سانتيگراد انکوبه نماييد ۲- .نمونه را در دماي ۳۵درجه نگهداري نماييد ۳- .هر ۲روز يکبار کشت را تجديد نمائيد ۴-