واکنش زنجیره ای پلی مراز

واکنش زنجیره ای پلی مراز

اسلاید 1: واکنش زنجیره ای پلی مراز گردآورنده: فاطمه ناصری(fnaseri55@gmail.com)- مهدی حیدرزاده(mehdihida@gmail.com) اداره کل دامپزشکی استان سیستان و بلوچستانبسم الله الرحمن الرحیم

اسلاید 2: بسم الله الرحمن الرحیم واکنش زنجیره ای پلی مراز :مخترع واکنش PCR کَری مولیس (Kary Mullis) می باشد که در سال 1983 این روش را جهت تکثیر DNA معرفی کرد. قبل از این کشف، ساخت قطعات DNA با روش های کند و پر هزینه شیمیایی انجام می گرفت. به دلیل اهمیت این اختراع، کاربردهای فراوان و نقش ارزنده آن در پیشرفت علم ژنتیک و زیست شناسی مولکولی، وی جایزه نوبل شیمی را در سال 1993 دریافت کرد.

اسلاید 3: واکنش PCR به طور روزمره در اکثر آزمایشگاه های تشخیصی و تحقیقاتی استفاده می شود و در موارد بسیاری مثل :شناسایی و جداسازی ژن ها کلونینگ طبقه بندی و شناسایی موجودات زندهتشخیص بیماری های ژنتیکی و حتی پرونده های جنایی و تعیین هویت کاربرد دارد.

اسلاید 4: استخراج ماده ژنتیکیاولین قدم در مهندسی ژنتیک جداسازی با خالص سازی DNA و RNA می باشد. که این کار دارای مراحلی است که عبارتند از : 1) شکستن سلولسلول های حیوانی(شوک اسمزی- سدیم دودسیل سولفات)سلول های گیاهی (پکتیناز و سلولاز)باکتری ها با توجه با گرم مثبت یا گرم منفی 2) رسوب دادن DNA و RNA :الکل سبب تجمع و رسوب ماده ژنتیکی می شود.3) جدا کردن DNA وRNA :4) رسوب پروتئین ها : (استفاده از فنل و یا محلول های غلیظ نمک های مختلف)5) جداسازی DNA و RNA از یکدیگر: (استفاده از DNase و RNase)6)رسوب ماده ژنتیکی با اتر 7) اسپکتروفتومتری:(جهت تایید استخراج)

اسلاید 5: PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction) تکنیکی است که با استفاده از آن می توان در مدت زمان کوتاهی قطعه خاصی از مولکول DNA را در شرایط آزمایشگاهی میلیون ها بار تکثیر نمود. این قطعه DNA ممکن است: یک ژن بخشی از یک کروموزوم یا بخش هایی از ژنوم یک موجود باشد.

اسلاید 6: اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی DNA در موجودات زنده توسط آنزیم DNA پلیمراز صورت می گیرد. در موجودات زنده، مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی DNA نقش دارند در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq polymerase به همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها جهت تکثیر قطعات DNA استفاده می شود.

اسلاید 7: ساز و کار (برنامه) واکنش PCRاساس واکنش PCR جهت تکثیر توالی DNA دو رشته ای، تغییرات دمایی می باشد. در ابتدا پیوندهای هیدروژنی دو رشته توالی DNA با حرارت (94-95 درجه سلسیوس) شکسته و دو رشته از یکدیگر جدا می شوند. سپس دمای واکنش پایین آورده می شود (معمولاً 50 تا 60 درجه سلسیوس). در این مرحله، دو قطعه کوتاه DNA تک رشته ای (معمولاً بین 18 تا 30 نوکلئوتید) که دقیقاً مشابه دو طرف قطعه DNA مورد نظر برای تکثیر طراحی و ساخته شده اند (با نام پرایمر یا آغازگر)، به توالی های مکمل خود در دو رشته باز شده DNA متصل می گردند. این دو قطعه انتهای 3’ آزاد جهت فعالیت آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می نماید، کاری که در همانند سازی در موجودات زنده توسط آنزیم پریماز و توالی اولیه ساخته شده توسط آن انجام می گیرد. در مرحله بعد، دمای واکنش تا 72 درجه سلسیوس (دمای مناسب آنزیم Taq polymerase) افزایش یافته و عمل تکثیر قطعه DNA مورد نظر بین دو پرایمر با استفاده از نوکلئوتیدهای موجود، توسط آنزیم Taq polymerase مقاوم به حرارت انجام می پذیرد.

اسلاید 8: DNA IN THE CELLNUCLEUSMITOCHONDRION

اسلاید 9: DNA STRUCTURE DEOXRIBO NUCLEIC ACIDDEOXYRIBOSE

اسلاید 10: DNA STRUCTUREPPPPP = PHOSPHATE

اسلاید 11: DNA STRUCTUREPPPPBASE=cytosine adenine thymine guanineCATGTBASEBASEBASEBASEBASE

اسلاید 12: DNA STRUCTUREPPPPPPCGATTGAC

اسلاید 13: POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)DNA

اسلاید 14: Denature DNA by heating

اسلاید 15: Primers (short pieces of DNA) bind to specific parts

اسلاید 16: New DNA made by DNA polymerase + subunits of DNA

اسلاید 17: New DNA made by DNA polymerase + subunits of DNA

اسلاید 18: repeat cycling

اسلاید 19:

اسلاید 20:

اسلاید 21: PCR

اسلاید 22: مرحله اول: واسرشت سازی (Denaturation)، 30 تا 60 ثانیهعمل انجام شده در این مرحله: جدا شدن دو رشته DNAمرحله دوم: اتصال (Annealing)، 30 تا 60 ثانیهعمل انجام شده در این مرحله: اتصال پرایمرها به نواحی مکمل روی DNA و تعیین محدوده تکثیر قطعه DNAمرحله سوم: گسترش (Extension یا Elongation)، به ازای هر 1000 نوکلئوتید طول قطعه 60 ثانیهعمل انجام شده در این مرحله: تکثیر قطعه DNA مورد نظراین 3 مرحله بین 25 تا 40 بار تکرار می شود که به آن چرخه های PCR می گویند.

اسلاید 23: heated lidsadjustable ramping timessingle/multiple blocksgradient thermocycler blocksThermocyclers

اسلاید 24: اجزا واکنش PCRدر یک واکنش PCR از: نمونه DNA آنزیم Taq polymerase پرایمرها (0.1 – 2.0 μM) بافریون منیزیم ( (1 – 5 mM نوکلئوتیدها (20 –250 μM) آب نوکلئاز فری PrimersDNA templateBuffer+ +A C T GMgCl2

اسلاید 25: نمونه DNA (الگو)< 0.1 ng plasmid DNA, 50 ng to 1 μg gDNA for single copy genes قطعه ای از DNA محصول استخراج DNA ژنومی DNA پلاسمیدی یا حتی محصول PCR از یک واکنش دیگر

اسلاید 26: معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA پلاسمیدی یا فاژی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است. بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر)می شود .مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد. کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل و EDTA، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گردد. همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری، به دلیل حساسیت فوق العاده این تکنیک، ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد.

اسلاید 27: آنزیم Taq polymeraseاین آنزیم برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده و پر مصرف ترین آنزیم مورد استفاده در PCR می باشد.اگرچه دمای مناسب برای این آنزیم 72 درجه سلسیوس می باشد ولی چون این آنزیم در دمای معمولی نیز قادر به تکثیر می باشد برای جلوگیری از اتصال قطعات پرایمر به نقاط دیگری روی توالی نمونه DNA و امکان تولید قطعات غیر اختصاصی، توصیه می شود که تمامی مراحل آماده سازی واکنش PCR بر روی یخ صورت گیرد.

اسلاید 28: نوکلئوتید هاچهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعه DNA از اجزا واکنش PCR می باشند که به عنوان واحد های ساختمانی مورد نیاز در ساخت قطعه DNA استفاده می شوند. غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر 200 نانو مولار می باشد. برای این منظور از مخلوط های آماده واجد هر چهار نوکلئوتید که با غلظت های مختلف مثل دو میلی مولار، 10 میلی مولار و 25 میلی مولار موجود است، استفاده می شود. به طور مثال، در یک واکنش 50 میکرو لیتری PCR باید 5 میکرو لیتر از مخلوط دو میلی مولار نوکلئوتیدها برای دستیابی به مقدار مورد نیاز در واکنش استفاده کرد.

اسلاید 29: بافرمهمترین نقش بافر PCR تنظیم pH مناسب واکنش PCR و آنزیم Taq polymerase می باشد.اجزای این بافر نقش های دیگری نیز دارند از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به DNA الگو (نمونه) کمک می کند.

اسلاید 30: یون منیزیمیون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش PCR می باشد. این یون برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است. برای تکثیر با Taq polymerase این یون عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم در واکنش PCR استفاده می شود. MgCl2 (mM) 1.5 2 3 4 5

اسلاید 31: غلظت بهینه یون منیزیم در واکنش PCR یک تا چهار میلی مولار است. غلظت بالاتر از این مقدار باعث تکثیر قطعاتی غیر از قطعه مورد نظر (قطعات غیر اختصاصی) شده غلظت پایین این یون نیز ممکن است به کاهش کارایی واکنش و میزان تولید قطعه مورد نظر منجر شود.

اسلاید 32: پرایمرهاغلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از 100 نانو مولار تا یک میکرو مولار متغییر است. غلظت بیش از این، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود.طول معمول پرایمرها : 18-24 باز باشد.TM بین 52 تا 65 درجه سانتی گراد مناسب است . تفاوت TM پرایمرها حداکثر 5 درجه سانتی گراد باشد . بهتر است آغاز و انتهای پرایمر با یک یا دو باز پورین آغاز و خاتمه یابد .پرایمر ها Blast شوند .(جلوگیری از دایمر)(بررسی اختصاصیت)فرمول محاسبه TM: TM=(A+T)*2+(G+C)*4بهترین دمای انلینگ 3-5 درجه کمتر از TM است .

اسلاید 33: Melting Temperature :Tm – the temperature at which half the DNA strands are single stranded and half are double-stranded.Tm is characteristics of the DNA composition; Higher G+C content DNA has a higher Tm due to more H bonds.

اسلاید 34:

اسلاید 35: وسایل مورد نیاز برای واکنش PCRحداقل وسایل مورد نیاز برای انجام واکنش PCR: دستگاه ترموسایکلر میکرو پیپت ظرف یخ وسایل یکبار مصرفی :مانند تیپ ، ویال و ظروف نگهداری آنها می باشد .

اسلاید 36: نكاتي در رابطه با تهيه واكنش PCR نگهداشتن ويال بر روي يخ در طول زمان افزودن اجزاء واكنش و مخلوط كردن آنها. تهيه واكنش در زير جريان هواي يك هود لامينار استريل (درمواردي كه در محل آزمايشگاه ازنوع DNA الگوي مورد نظر كار ما زياد استفاده مي شود)بهتر است ابتدا آب واكنش در ويال کوچک ريخته شود.به حداقل رساندن شانس اتصال پرايمر به DNA (ترجيحاً DNA الگو آخرين افزودني قبل از آنزيم باشد)افزودن آنزيم پليمراز به عنوان آخرين ماده واكنش.

اسلاید 37: PCR PROCESSDenaturation 15 Sec- 2 min 95 CAnnealing 30- 60 Sec 40-60 CExtension 1-2 min 72 C jhj

اسلاید 38:

اسلاید 39: نكاتي در رابطه با مشاهده باند غير اختصاصي غلظت پرايمر خيلي زياد است.دماي Annealing پائين است خصوصاً در سيكل‌هاي اول دماي پائين Annealing سبب اتصال غير اختصاصي پرايمر به الگو مي‌گردد.مي توان غلظت يون منيزيم را كاهش دادغلظت dNTP خيلي بالا است.دناتوراسيون DNA الگو بطور كامل نيست.زمان سيكل‌ها را مي‌توان كمي كاهش داد.سرعت RAMP خيلي كند است.گاهي انجام يك واكنش NESTED PCR باند اضافي را حذف مي‌كند.بريدن باند مورد نظر از روي ژل آگارز، تخليص آن و سپس Reamplify آن نيز توصيه مي‌گردد.در طراحي پرايمر اشكال بوده است

اسلاید 40: انواع روشهای PCRمالتيپلكس پي سي آر (‏(Multiplex-PCR‏ :- يكي از روش‌هاي تغييريافته ‏PCR‏ است كه در آن با استفاده از پرايمرهاي مختلف مي‌توان چندين جايگاه را مورد بررسي قرار داد و از چندين جفت پرايمر اختصاصي جهت تكثير استفاده مي‌شود. كاربردهاي اين روش مي‌تواند شامل موارد زير باشد: ‏ ‏1) بخش‌هاي بزرگي از يك ‏DNA‏ (هدف)، جهت جست‌وجوي تغييرات مي‌تواند بررسي شود. ‏2) بخش‌هاي غيرمربوط به هم در ژنوم هدف مي‌تواند مورد آزمايش واقع شود. ‏3) مي‌توان از طريق اين روش با پرايمرهاي مختلف به جست‌وجوي عوامل مختلف پرداخت، مانند شناسايي عوامل شايع مننژيت. اين روش بيشتر براي شناسايي جايگاه‌هايي از ژن‌ها به كار مي‌رود كه انواع زيادي از جهش در آنها به وقوع مي‌پيوندد.‏

اسلاید 41: زمانيكه بهترين شرايط اتصال فراهم شود باندهاي غير اختصاصي ممكن است قبل از انجام اولين چرخه PCR ايجاد شود . حتي تا وقتي كه دماي لوله ها تا70-65 درجه سانتی گراد افزايش مي يابد اتصالات غير اختصاصي پرايمر/پرايمر و پرايمر/ الگوممكن است بوجود آيد و بعنوان سوبستراي اوليه براي DNAپليمراز عمل كند.ساده ترين روش براي جلوگيري ازچنين اتصالات اوليه غيراختصاصي و بهتركردن شرايط اتصال صحيح پرايمر، استفاده از روش Hot start است كه اساس اين روش بر جدا كردن مواد واكنش تا زمان رسيدن به دماي بالا مي باشد.يك يا چندماده قبل از رسيدن به دماي بالاتر از 70 درجه سانتی گراد از واكنش جدا مي شود و پس از رسيدن به دماي بالا در واكنش وارد مي كنند.روشهای جداسازی : فیزیکیشیمیاییHot-Start PCR:

اسلاید 42: PCR Real timeاین روش کمی است . - در اين سيستم يك ماده فلورسانت در طي واكنش متناسب با ميزان محصولات هرسيكل آزاد ميشود و ميزان فلورسانت آن توسط دتكتورشناسايي وثبت ميگردد و بدين ترتيب ميزان DNAتكثير شده طي يك چرخه تا چرخه بعدي را ميتوان اندازه گيري كرد. - ميزان محصول در هرچرخه قابل رديابي است در حاليكه محصول روشهاي سنتي پس از پايان واكنش و الكتروفورز مشخص ميشود.روشهاي سنجش با Real time PCR :1- استفاده از رنگهاي فلورسنت مثل سايبرگرين:همزمان با دورشته اي شدن DNA سايبرگرين به شيار كوچك DNAمتصل ميشود و با جذب طول موج 498نانومتري، نور522 نانومتري را ساطع ميكند. با افزايش مقدار محصول PCRرنگ بيشتري متصل ميشود و ميزان فلورسانس افزايش مي يابد، پس ميزان فلورسانس متناسب با مقدار DNA دو رشته اي در واكنش است اما مهمترين عيب آن اتصال به دو رشته هايي مثل پرايمردايمر و ديگر باندهاي غيراختصاصي است كه باعث مي شود نتايج بيشتر از غلظت اصلي برآورد شود. 2- استفاده از پروبهاي فلورسنت:پروبها برخلاف سايبرگرين بر اساس تشخيص اختصاصي توالي محصول كار ميكنند.

اسلاید 43: آرتي - پي‌سي آر (‏RT-PCR‏)به خاطر اینکه آنزیم DNA پلی مراز به DNA دو رشت ای برای رونوشت برداری نیاز دارد، لذا بایستی ابتدا RNA را به cDNA(complementary DNA) DNA- مکمل- تبدیل کنیم . اين روش به ‏PCR‏ نسخه‌برداري معكوس نيز معروف است كه ماده اوليه در آن ‏RNA‏ است. اولين مرحله در اين روش تبديل ‏RNA‏ به ‏cDNA‏ توسط آنزيم نسخه‌بردار معكوس صورت مي‌گيرد (‏RT‏). برخي از موجودات مانند برخي از ويروس‌هاي ‏RNAدار، ژنومشان تنها از ‏RNA‏ ساخته شده است. كاربرد اين آنزيم به‌دليل آن‌كه آنزيم به حرارت حساس بود در ابتدا پايين بود ولي با كشف باكتري به نام ترموس ترموفيلوس يك ‏DNA‏ پليمراز مقاوم به نام (‏Tth‏) بهبود يافت كه در حضور يون ‏Mn+2‎‏ داراي فعاليت نسخه‌برداري معكوس است و در دماي 72 درجه سانتيگراد توسط اين آنزيم از روي ‏RNA، ‏DNA‏ ساخته مي‌شود و سپس ‏Mn+2‎‏ اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسدي (‏EGTA‏) حذف مي‌شود و سپس اين آنزيم از ‏DNAاي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير مي‌كند.‏

اسلاید 44: آرمز پي‌سي‌آر (‏ARMS-PCR‏)‏- اين روش تكثيري قدرتمند براي مشخص كردن جهش‌هاي نقطه‌اي است.در اين روش از پرايمرهاي جهش يافته و طبيعي در دو لوله جداگانه استفاده مي‌شود. اگر عمل پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود، نشان‌دهنده نبود جهش نقطه‌اي در باز مورد نظر است و اگر عمل پليمريزاسيون در لوله‌ حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود، نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌اي در باز مورد نظر است.

اسلاید 45: نستد پي‌سي‌آر (‏Nested-PCR‏)در اين روش از دو جفت پرايمر استفاده مي‌شود، طوري كه جفت دوم در بین جفت اول جاي مي‌گيرد. در اين روش ابتدا پرايمر بيروني توالي هدف در طول 30-15 چرخه تكثير مي‌شود، سپس محصول ‏PCR‏ حاصل به لوله‌اي ديگر منتقل مي‌شود و به‌عنوان الگو و با استفاده از جفت پرايمر داخلي مرحله دوم ‏PCR‏ انجام شده و ترادف كوچكتري از ‏DNA‏ كه درون ‏PCR‏ اولي است، به اندازه 40-15 چرخه تكثير مي‌شود.‏ مزاياي اين روش تغيير يافته ‏PCR‏ عبارت است از: نياز به تأييدهاي بعدي كمتر است.حساسيت در اين روش به ميزان زيادي بالاتر است .به دليل انتقال محصول ‏PCR‏ دور اول به لوله جديد، ممانعت كننده‌ها رقيق مي‌شود.اين روش در تعيين جنسيت جنين در سه ماهه اول بارداري استفاده شده و از اين طريق توانسته‌اند بيماري‌هاي وابسته به جنس را تعيين كرده و از تولد كودكان بيمار جلوگيري كنند.‏ همچنين ويروس سيتومگالوويدوس كه مي‌تواند سبب ناشنوايي در 1% از كودكان شود، توسط اين روش تشخيص داده شده و امكان درمان زودهنگام از اين طريق امكان‌پذير است. جنين‌هاي مبتلا به سندروم داون نيز در مرحله بارداري مادر با اين روش تشخيص داده شدند.

اسلاید 46: ELECTROPHORESIS+ VE- VE

اسلاید 47: ELECTROPHORESIS+ VE- VE

اسلاید 48: ELECTROPHORESIS+ VE- VE

اسلاید 49: ELECTROPHORESIS+ VE- VE

اسلاید 50:

اسلاید 51:

اسلاید 52: الکتروفورز

اسلاید 53:

اسلاید 54:

اسلاید 55:

اسلاید 56: DNA Size from Agarose Gel Electrophoresis: Compares unknown DNA to known size standards

اسلاید 57:

اسلاید 58:

اسلاید 59:

اسلاید 60:

اسلاید 61:

اسلاید 62:

اسلاید 63:

اسلاید 64:

اسلاید 65: با تشکر فراوان پایان