دستورالعمل تشخیص آزمایشگاهی باکتریهای مولد اسهال

دستورالعمل تشخیص آزمایشگاهی باکتریهای مولد اسهال

اسلاید 1: بنام خدا

اسلاید 2: دستورالعمل تشخيص آزمايشگاهي باکتریهای مولد اسهال

اسلاید 3: نمونه گيرياولين قدم در راه تشخيص صحيح آزمايشگاهي ، نمونه گيري دقيق و درست در زمان بروز بيماري است.نمونه گيري مدفوع بايستي در مراحل اوليه بيماري (حداكثر ظرف 1 تا 2 روز كه عامل بيماري زا به تعداد بيشتري در مدفوع وجود دارد) و قبل از درمان با آنتي بيوتيك صورت پذيرد.نمونه مدفوع (در صورت قوام دار بودن حداقل 5 گرم و يادر صورت کاملا آبکی بودن معادل 5 سی سی) نسبت به سواب برتری دارد وحداقل بايد دو نمونه سوآب مقعدي يا سوآب از مدفوع تازه براي هر بيمارجمع آوري و در محيط انتقالCary Blair تلقیح شود.

اسلاید 4: تهيه نمونه مدفوع و سوآب از مدفوعبراي نمونه مدفوع ، از يك ظرف درپيچدار تميز با اندازه مناسب استفاده نماييد .هنگامي كه نمونه به آزمايشگاه مي رسد لازم است به سرعت آزمايش بر روي آن انجام شود . ( بيشتر از 2 ساعت از زمان نمونه گيري نگذشته باشد.)اگر ناچار به نگهداري نمونه ها بيشتر از 2 ساعت هستيد ، سو آب را درون نمونه مدفوع قرار داده و پس از حركت چرخشي ، آن رادر يك محيط انتقالي تلقيح كنيد.اگر مدفوع حالت مخاطي دارد سعي كنيد نمونه را همراه مخاط در محيط ترانسپورت تلقيح نماييد.

اسلاید 5: سوآب مقعديبراي نمونه گيري از سوآب پنبه اي سالم استفاده كنيدو دقت كنيد كه پنبه سر آن كنده نشده باشد.ابتدا سوآ ب را با فرو كردن در محيط ترانسپورت استريل مرطوب كرده و سپس به اندازه2/5تا 3/5سانتی متر داخل اسفنكتر ركتوم نموده و بچرخانيد و بيرون بكشيد . با توجه به تغيير رنگ پنبه ي سر سوآ ب مطمئن شويد سوآ ب به مدفوع آغشته است .تعداد سوآب مورد نياز بستگي به تعداد عوامل پاتوژن مورد مطالعه دارد.معمولاحداقل 2 سوآ ب بايد تلقيح شود .

اسلاید 6: دستورالعمل عمومی برای جمع آوری نمونه نمونه را قبل از درمان آنتی بیوتیکی جمع آوری کنید. امکان آلوده شدن نمونه را با عوامل داخلی وخارجی را به حداقل برسانید. برروی ظرف نمونه، اسم بیمار، تاریخ وساعت نمونه برداری و شماره آن را بنویسید. نمونه باید به اندازه کافی باشد، مقادیر ناکافی نمونه باعث جواب منفی کاذب می گردد.درخواست کشت وبررسی باید مشخص گردد.درغیراینصورت آزمایشگاه تنها نمونه را ازنظر سالمونلا، شیگلا بررسی می کند نمونه را دریک ظرف درب دار با درب محکم جمع آوری کنید

اسلاید 7: ملاحظات عمومی نمونه مدفوع را خنک نگهدارید و آن را انکوبه نکنید.اگر نمونه مدفوع را نمی توان درعرض یک یا دو ساعت بعد ازجمع آوری، کشت داد، آن را باید به محیط ترانسپورت (برای مثال کاری-بلر یا بافر نمکی گلیسرول) انتقال داد.ازکاغذ توالت برای جمع آوری مدفوع استفاده نکنید. کاغذ توالت ممکن است حاوی نمکهای باریم باشد که برای بعضی پاتوژنهای مدفوعی مهارکننده رشد هستند

اسلاید 8: نمونه های مدفوع قابل پذیرش برای کشت دستورالعمل کلی: با ادرار آلوده نشده باشد.قسمتی از مدفوع را که حاوی چرک، خون یا موکوس است برای کشت انتخاب کنید.حدود 5 گرم مدفوع برای کشت کافی است.بعضی ظروف مدفوع دارای خطوطی هستند که مقادیر را نشان می دهد.ارسال نمونه در2تا 3 روزجداگانه امکان جداسازی یک پاتوژن را افزایش می دهد.

اسلاید 9: مدفوع باید تازه باشد و1 تا 2ساعت بعد از نمونه برداری به آزمایشگاه برسد. درمحیط نگهدارنده بافرنمکی گلیسیرولهترانسپورت کاری-بلر حرارت 4 تا 6 درجه سانتیگراد به آزمایشگاه ارسال شود.سواب رکتال حتما باید درمحیط ترانسپورت ارسال شود.

اسلاید 10: تلقيح به محيط انتقال در صورتي كه ناچار به تلقيح نمونه پس از 2 ساعت باشيم لازم است نمونه ها را در يخچال و يا در محيط هاي انتقالي جهت بقا بيشتر قرار دهيم . محيط انتقالي تلقيح شده نيز بايد در سرما نگهداري شود . زيرا اين شرايط براي پاتوژن هايي مانند شيگلا و كمپيلوباكتر بسيار مهم است . البته بيشتر عوامل پاتوژن به استثنا اين دو ارگانيسم قابليت زنده ماندن براي مدتي در محيط انتقالي ، دردماي محيط را دارند (حداكثر يك هفته ). هنگامي كه نمونه ها در محيط انتقالي قرار داده شده و نياز به نگهداري آنها براي مدت بيشتري مي باشد لازم است كه در يخچال يا فريزر نگهداري شوند.

اسلاید 11: Cary Blair محيط انتقالبراي نگهداري و انتقال سالمونلا ، شيگلا،ویبریو کلره،اشریشیاکلی و یرسینیا انتروکولیتیکا بسيار مورد استفاده قرار مي گيرد.این محیط به میزان 5 سی سی(PH=8.4) در لوله در پيچدار با اندازه متوسط ريخته مي شود و بايد قبل از استفاده و بعد از تلقيح نمونه به آن در یخچال نگهداری شود. اين محيط انتقالي پس از آماده سازي حداكثر12 ماه قابل استفاده است به شرطي كه، حجم آن كاهش پيدا نكرده و هيچگونه علائم آلودگي و تغيير رنگ در آن مشاهده نشود.

اسلاید 12: مراحل تلقيح نمونه در محيط انتقاليحداقل 2 سوآب مدفوع يا مقعدي را به ته لوله حاوي محيط وارد كنيد.پس از قرار دادن سوآب در لوله قسمت چوبي بيرون از لوله را بشكنيد.در لوله را محكم ببنديد.-نمونه ها را داخل يخچال نگهداري كنيد و اگر امكان نگهداري در يخچال وجود نداردمحيط انتقال حاوي سوآ ب را در مكاني خنك ودور از نور جهت پايين نگه داشتن دما قرار دهيد.

اسلاید 13: محيطهاي كشت محیطهای انتفال نمونهمحيطهای كشت اولیهمحیطهای شناسائی

اسلاید 14: نیاز به محیط مغذی، افتراقی وانتخابیمحیط روده حاوی باکتریهای هوازی–بی هوازی- عدم رشد باکتریهای بیهوازی بعلت انکوباسیون هوازی- وفور باکتریهای هوازی گرم منفی ومثبت- تعداد کم عوامل پاتوژن نسبت به فلورنیاز به محیط مغذی، افتراقی وانتخابی است تا امکان یافتن پاتوژن را افزایش دهیم

اسلاید 15: محيطهاي كشت اولیهمحیط های کشت روتین برای سالمونلا وشیگلا به چهارگروه عمده تقسیم می شوند:آبگوشت مغذی محیط افتراقی محیط های نسبتا انتخابی محیط های فوق العاده انتخابی

اسلاید 16: آبگوشت مغذی استفاده ازاین محیط باعث جلوگیری از رشد فلورطبیعی درطی ساعت اولیه انکوباسیون می شود. با ساب کالچرازاین محیط شانس یافتن تعداد کم پاتوژن در نمونه افزایش می یابد.Gram negative (GN) Brothالف)S Fب )سلنیت F

اسلاید 17: GNآبگوشت مغذی جداسازی شیگلا وسا لمونلا با کشت دراین آبگوشت بیش ازوقتی است که نمونه مدفوع بطورمستقیم برروی محیط اختصاصی کشت داده شود.روش عمل : تریپتوز دراین محیط بعنوان ماده مغذی عمل می کند.سیترات و دزوکسی کولات بعنوان ماده انتخابی عمل کرده ورشد باکتریهای گرم مثبت و بعضی کلی فرمها را مهار می کند.مانیتول موجود درمحیط رشد سالمونلا وشیگلاهای متابولیزه کننده مانیتول را افزایش می دهد.بافر فسفات ازکاهش pH واسیدی شدن آن جلوگیری می کند

اسلاید 18: محیط آبگوشت مغذیبعد از کشت نمونه درآبگوشت مغذی نمونه را از روی این محیط برروی محیط های افتراقی یا انتخابی کشت دهید. بعد از 4تا 6 ساعت GN.SF broth بعد از 12 ساعت و بعد از آن هرچه سریعترپلیت ها را سپس در35 تا 37 درجه انکوبه کنید

اسلاید 19: محیط افتراقیباعث تمایز باکتریهای لاکتوز منفی از لاکتوزمثبت می شود وجلوی رشد باکتریهای گرم مثبت رانیز می گیرد.الف) مک کانکی آگارEMBب) لاکتوز منفیلاکتوزمثبتمک کانکی آگارEMB

اسلاید 20: محیط های فوق العاده انتخابی این محیطها بطور روتین استفاده نمی شود.گران قیمت هستند.درموارد بررسی Outbreak توصیه می شود.برای سالمونلا مناسب هستند ولی برای شیگلا مناسب نیستند.الف) بریلیانت گرین برای سالمونلا بجز سالمونلا تیفی وسالمونلا پاراتیفی ب) بیسموت سولفیت برای سالمونلا مخصوصا تیفی

اسلاید 21: محیط های نسبتا انتخابی این محیط ها باعث جلوگیری از رشد اکثر اعضاء خانواده آنتروباکتریاسه می شود.به سالمونلا وشیگلا اجازه رشد می دهند.تولید SH2 را معین می کند.الف) Hektoen enteric agar (HE)ب) Xylose –lysine-desoxycholate(XLD)ج) Salmonella-Shigella agar (SS)د) دزاکسی کلات

اسلاید 22: محیط XLDسدیم دزوکسی کولات باعث مهار بعضی باکتریهای فلورطبیعی روده فنل رد معرف pH فلور طبیعی گزیلوز، سوکروز ولاکتوز را تخمیر  کلنی های زرد (ناشی از اسید)شیگلا ،|پرویدنسیا وبعضی گونه های پروتئوس این قندها را تخمیر نمی کنند کلنی های قرمز(ناشی از قلیا)سالمونلا وادوارد سیلا گزیلوز را تخمیر می کند ولی سوکروز یا لاکتوز را تخمیر نمی کندو ایجاد اسید می کند ولی چون لیزین موجود درمحیط را دکربوکسیله می کند وقلیا ایجاد می کند.به اسید ایجاد شده برتری می یابد وکلنی های قرمز(ناشی ازقلیا) ایجاد می کند وSH2 تولید شده باعث ایجاد کلنی های با مرکزسیاه می شود.

اسلاید 23: Xylose lysine desoxycholate(XLD)Salmonella-Shigella agar(SS

اسلاید 24: lactose-fermenting ٫A. Surface of MacConkey agar with 24-hour growth of redcolonies . The diffuse red color in the agar surrounding the colonies is produced ٫ by organisms that avidly ferment lactose . producing large quantites of mixed acids and cause precipitation of the bile salts in the medium surrounding the col-or . ( e.g. Escherichia coli )lactose-fermenting colonies ٫ B. Surface of MacConkey agar illustrating both red clear non-lactose-fermenting colonies . ٫and smaller

اسلاید 25: C and D. Surface of EMB agar plates illustrating the green sheen produce by av-id lactose (or sucrose) fermenting members of the Enterobacteriaceae . Most st- and since E. coli rains of E. coli produce colonies with this appearance of EMB agarthe appearance of ٫ is among the most frequent isolates from clinical specimens٫ such colonies can often serve as presumptive identification of E. coli . howevercharacteristics other than the production of a green sheen on EMB must be asse-since other lactose-٫ sed before an organism can be definitely identified as E. coli fermenting Enterobacteriaceae can have a similar appearance .

اسلاید 26: روش كار محیط XLD بعد ازکشت پلیت ها را 24- 18 ساعت دردمای 35 درجه انکوبه می کنیمخواندن پلیت ها الف) کلنی های زرد  گونه های اشرشیاکلی ، انتروباکتر، کلبسیلا و سراشیا، سیتروباکتر دیورسوس و یرسینیا آنتروکولیتکا ب) کلنی زرد با مرکز سیاه سیتروباکتر فروندی ، پروتئوس ولگاریسج) کلنی های قرمز شیگلا ، پروید نیسیا ، سالمونلا SH2 منفید) کلنی قرمز با مرکز سیاه گونه های سالمونلا و ادوارد سیلا ُ

اسلاید 27: نکات قابل توجه در مورد ساخت محیط محیط XLD باید قرمز روشن باشد. اگر محیط موقع ساختن زیاد حرارت ببیند، سبب رسوب سدیم دزاکسی کولات می گردد که باعث می شود کلنی ها کوچکتر، تیره تر ظاهر شوند.

اسلاید 28: محیطهای شناسائی TSIیک محیط افتراقی برای باکتریها ی گرم منفی براساس تخمیرقندها گلوکز،لاکتوز و سوکروز وتولید SH2 است که باکتریها را به دو گروه لاکتوزمثبت ومنفی تقسیم می کند.

اسلاید 29: روش کار: - با استفاده از یک آنس از مرکز یک کلنی ایزوله برداشت کنید.نوک آنس را درداخل قسمت پائین لوله وارد کنید و بعد در سطح شیب دار کشت دهید.درب لوله را محکم نبندید.در35 درجه بمدت 18تا 24ساعت انکوبه کنید.

اسلاید 30: بررسي لوله ها TSI A/A,G+ A/A,SH2 K/A , SH2+ K/A , SH2- K/K , SH2-

اسلاید 31: آزمون های بیوشیمیایی اورهاندول،MR-VP سیترات حرکتLDC مالونات

اسلاید 32: اوره توانائی ارگانیسم به هیدرولیز اوره و تبدیل آن به آمونیاک و CO2 باعث تغییر معرف فنل رد از رنگ نارنجی به رنگ صورتی می گرددروش کار: یک کلنی کامل از باکتری یا مقداری از کشت خالص را روی محیط مایع کشت دهید ودردمای 35 درجه انکوبه کنید اوره مثبت اوره منفی کشت نشده

اسلاید 33: اندولاندول یکی از مواد حاصل از متابولیسم تریپتوفان است که در اثر ترکیب با آلدئید ها (معرف کواکس) رنگ ایجاد می کند.روش کار یک کلنی ایزوله درمحیط آبگوشت تریپتوفان (اندول) کشت دهید وبمدت 24-18 ساعت در 37 درجه انکوبه کنید.5 قطره معرف کواکس را به آن اضافه کنید. رنگ صورتی درسطح محیط نشانه مثبت بودن و رنگ زرد نشانه منفی بودن تست است.مثبتمنفی

اسلاید 34: آزمایش متیل رد میزان کاهش pH بوسیله یک ارگانیسم تخمیرکننده گلوکز را مشخص می کند.اگرکاهش pH به 5 برسد باعث می شود که معرف به رنگ قرمز درآید ولی اگر pH 8/5 باشد، به رنگ زرد درمی آید.

اسلاید 35: روش کار الف) در 5 میلی لیتر محیط MR-VP کشت دهید وبمدت 48 ساعت در 35 درجه سانتی گراد انکوبه کنید.ب) 5/2 میلی لیتر آن را به لوله باریک منتقل کنید.ج) 5 قطره از معرف متیل رد را به آن اضافه کنید.واکنش مثبت با رنگ قرمز واکنش منفی با رنگ زرد مایل به نارنجی

اسلاید 36: آزمون VP دراثرمتابولیزه کردن گلوکزمتابولیتی به نام استوئین بوجود می آید که درحضوراکسیژن وKOH تولید کمپلکس قرمزرنگی را می کند.حساسیت تست با افزودن α- نفتول قبل از KOH افزایش می یابد

اسلاید 37: روش کار باکتری را در5 میلی لیترمحیط MR-VP کشت دهید و درحرارت 35 درجه سانتی گراد بمدت 48 ساعت انکوبه کنید 2/5 میلی لیترازآن را به لوله دیگر انتقال دهید. سپس 6 قطره ازمعرف A (α- نفتول) و 2 قطره از معرف B(KOH 40%) به آن بیفزائید. بمدت 10 تا 15 دقیقه انکوبه کنید.واکنش مثبت تشکیل رنگ صورتی مایل به قرمز

اسلاید 38: سیترات بعضی باکتریها قادرند که سیترات را بعنوان تنها منبع کربن و نمک های آمونیوم را بعنوان تنها منبع نیتروژن استفاده کنند که باعث ایجاد محیط قلیایی وتغییر رنگ معرف (برم تیمول بلو) از سبز به آبی می گردد.

اسلاید 39: تست سیمون سیتراتNegative ResultPositive ResultUses citrate as sole carbon sourceCitrate utilization - Simmon’s citrate agar slant (S/C)Streak slant and stab butt, Incubate up to 30 days.

اسلاید 40: سیتراتروش کار : باکتری را در روی سطح شیب دار محیط کشت دهید ودرب لوله را محکم نبندید. لوله را در 35 درجه سانتی گراد بمدت 24 ساعت تا 4 روز انکوبه کنید.سیترات مثبتسیترات منفی

اسلاید 41: آزمون حرکت سویه های حرکت دار درسرتاسر محیط رشد خواهند داشت درحالیکه سویه های بی حرکت فقط درمسیر کشت آنس رشد می کند.روش کار با یک آنس درمحیط حرکت بطور عمودی کشت دهید وانکوبه کنید.

اسلاید 42: 1/14/2018Dr.M.Sharifi42

اسلاید 43: دکربوکسیلاز لیزین LDC تولید آنزیم دکربوکسیلاز با اثر برروی قسمت کربوکسی اسیدآمینه لیزین تولید ماده ای به نام کاداورین Cadaverine می کنند.این واکنش بی هوازی است بنابراین باید روی محیط با پارافین مایع پوشانده شود. بعنوان شاهد ازمحیط پایه فاقد اسیدآمینه استفاده می شود.اگر ارگانیسم درمحیط رشد کند،هم محیط کنترل (پایه) وهم محیط حاوی اسیدآمینه بعلت تخمیر مقادیر کم گلوکز و تولید اسید به رنگ زرد درمی آیند.اگر اسیدآمینه دکربوکسیله شود تولید شرایط قلیایی می کند ورنگ محیط را به رنگ اولیه (ارغوانی ) برمی گرداند

اسلاید 44: روش کار باکتری را ابتدا درمحیط پایه وسپس درمحیط حاوی اسید آمینه کشت دهید. روی محیط را با پارافین مایع استریل بپوشانید. در 35 درجه سانتی گراد انکوبه کنید.واکنش مثبت درعرض 1تا2 روز رخ میدهدواکنش منفی را بعد از 4روز گزارش کنید واکنش منفیواکنش مثبتمحیط کشت نشده

اسلاید 45: LIA left to right: K/K (+decarboxylation, without H2S ) , K/A H2S (- decarboxylation with H2S ), K/K H2S (+decarboxylation with H2S ),R/Y (- decarboxylation, + deamination, without H2S )

اسلاید 46: فنیل آلانین دآمینازجهت تمایز باکتری پروتئوس وپرویدنسیا از سایر انتروباکتریاسه ها ازتست بیوشیمیایی فنیل آلانین دآمیناز استفاده میگردد.بعد از کشت باکتری برروی محیط فنیل آلانین وانکوباسیون به مدت 24 ساعته در 37-35درجه .بااستفاده از محلول کلرورفریک10درصد بر روی کشت مذکور ، در صورت ایجاد رنگ سبز رنگ ، نتیجه آزمایش فنیل آلانین مثبت بودن باکتری را مشخص می نماید.

اسلاید 47: 1/14/2018Dr.M.Sharifi47

اسلاید 48: Positive: dark green color on slant  phenlyalanine metabolized to phenylpyruvic acidNegative: no color changeInterpret immediately1/14/2018Dr.M.Sharifi48

اسلاید 49: مالوناتمالونات سدیم براث این محیط برای آزمایش مصرف سدیم مالونات بوسیله اعضای خانواده آنتروباکتریاسه مورد استفاده قرار می گیرد.آزمایش مثبت بوسیله تغییر رنگ محیط از سبز به آبی نیلی می گرددباکتری را درمحیط کشت دهید. در 35 درجه سانتی گراد انکوبه کنید

اسلاید 50: جداسازي و تشخیص آزمایشگاهیباکتري هاي سالمونلا و شیگلا

اسلاید 51: بررسی ماکروسکوپینمونه هاي مدفوع باید از نظر ظاهر بررسی گردند و از نظر وجود لخته خون، موکوس و قوام مدفوع مشاهدات ثبت شوند.بررسی میکروسکوپیبا تهیه اسمیر نازك از مدفوع و رنگ آمیزي گرم می توان وجود گلبولهاي سفید، همچنین غالب بودن یک مورفولوژي باکتریایی، وجود سلولهاي مخمر یا عدم وجود باسیلهاي گرم منفی روده اي را در مدفوع تعیین نمود.

اسلاید 52: انتخاب محیط هاي کشتمحیطهاي پلیتی افتراقی و انتخابی:براي کشت روتین مدفوع، جهت جداسازي باکتریهاي بیماریزاي روده اي باید از محیط هاي افتراقی و انتخابی زیر استفاده شود:محیطMacConkey Agar که همه باسیلهاي گرم منفی روده اي بتوانند روي آن رشد کنندمحیط افتراقی- انتخابیXLD (Xylose-Lysine Decarboxylate) از محیطHektoen Enteric Agar هم میتوان به جای XLD استفاده نمود.

اسلاید 53: تلقیح محیط هاي کشت و انکوباسیونتلقیح محیط هاي پلیتی:درصورتی که نمونه سوآب رکتال باشد، سوآب را روي سطح پلیت به قطر حدود2/5 سانتیمتر می چرخانیم. سپس سطح پلیت را با لوپ استریل از منطقه تلقیح در تمامی پلیتStreak کرده به طوري که کلنی هاي جدا از هم بدست آید.، پلیت ها را به مدت 24 ساعت در 37 -35درجه انکوبه می کنیم در صورت عدم رشد یا رشد ضعیف انکوباسیون را تا 48 ساعت ادامه می دهیم.براي هر بیمار استفاده از یک پلیت با قطر 10-8 برای هر بیمار الزامیست و نباید از پلیت 6سانتی متر استفاده نمود، زیرا احتمال جداسازي کاهش می یابد.. در مواردي که نمونه مدفوع قوام دار است توصیه می شود، کشت از سوسپانسیون مدفوع در سرم فیزیولوژي انجام گردد.

اسلاید 54: تلقیح محیط مایع غنی کنندهنمونه را با سواب به داخل محیط GN براث یا SF براث برده سواب را دور می اندازیم.معمولا برای GNبراث 8-6ساعت انکوباسیون و محیط SF براث 8-12 ساعت انکوباسیون توصیه میشود.بعد از این زمان از سطح محیط براث بدون مخلوط کردن یک لوپ برداشته، روي پلیت MAC و XLD کشت می دهیم، به طوري که کلنی هاي جدا از هم بدست آید.

اسلاید 55: گر مخانه گذاري پليت ها را به صورت وارونه در ٢ ± ٣۶ درجه سلسيوس به مدت24- 18 ساعت در گرم خانه قرار دهيد

اسلاید 56: محیط SS براي جداسازي سالمونلا به کار می رود، اما باعث مهار رشد برخی از گونه هاي شیگلا می شود.محیطXLD چون میزان مهار کنندگی کمتري روي رشد کلی فرمها دارد، براي جداسازي شیگلا مناسب تر ازHE است

اسلاید 57: محیط هاي مایع غنی کنندهاستفاده از این محیط ها به منظور بازیافت مقادیر کم سالمونلا یا شیگلا در افراد بدون علامت ناقل ، و بویژه در میان کارکنان داراي مشاغل حساس(مانند افراد شاغل در مهدهاي کودك، آشپزخانه ها و..) الزامیست.رایجترین این محیط هاGN براث وSF براث میباشند.SFبراث براي جداسازي سالمونلا مناسب است، ولی براي برخی از گونه هاي شیگلا داراي اثر مهارکنندگی بوده، لذا بهتر است در موارد مشکوك به جدا سازي شیگلا از این محیط استفاده نشود.هنگام ساخت محیط SF براث حرارت دادن بیش از اندازه باعث ایجاد ذراتی در محیط می شود که در این صورت نمی توان از آن استفاده کرد.

اسلاید 58: بررسی اولیه وجستجوی محیطهای کشت مدفوع برای سالمونلا و شیگلا لاکتوز بعنوان اولین کلید شناسائی سالمونلا وشیگلا است. کلنی های لاکتوز مثبت محیط های Mac, SS  قرمز تا صورتی محیط XLD  زردرنگ کلنی های لاکتوزمنفی و یا تخمیرکننده های تاخیری لاکتوز (Late fermenters) سالمونلا يا شیگلا و پروتئوس وغیره محیط Mac,SS تولید کلنی های بی رنگ روی محیط XLD کلنی های قرمزرنگ

اسلاید 59: توجه اگر کلنی مشابه به سالمونلا یا شیگلا برروی محیط های فوق مشاهده نشد، محیط ها را 24 ساعت دیگر انکوبه کنید

اسلاید 60: بررسي پلیت ها و جداسازی کلنی ها حتی افراد باتجربه هم ممکن است درتشخیص ظاهر کلنی ها اشتباه کنند بنابراین توصیه می شود 2 کلنی مشخصه ازهرتیپ کلنی سالمونلا یا شیگلا را برداشت کرده و با آنس برروی عمق و سطح TSI کشت داده شود.ازهمان کلنی در محیط اوره کشت دهید

اسلاید 61: بررسی وخواندن واکنش TSI ََ A/Aاین ارگانیسم ها سالمونلا یا شیگلا نیستند.

اسلاید 62: A/A,SH2+ سیتروباکتر، پروتئوس ولگاریس ، آریزونا

اسلاید 63: K/A , SH2+ اوره مثبت  پروتئوس

اسلاید 64: تست اوره در مورد پروتئوس مثبت استPositive ResultNegative ResultUrea hydrolysis - Urea brothAfter heavy inoculation, incubate up to 30 days.

اسلاید 65:

اسلاید 66: K/A , SH2+ اوره منفی: احتمالا سالمونلا

اسلاید 67: انجام آزمایشات بیوشیمیایی MR(+) VP(-)حرکت(+) Citrate(+)Malonate (-) Indole(-) LDC (+) Most salmonella are citrate positive, except S. typhi, S.paratyphi A, S. sendi, S. pullorum, S. gallinaurm and few other types.

اسلاید 68: K/A (بدون گاز و (SH2 اوره منفی  سالمونلا (تیفی)، شیگلا، K/A (بدون گاز و SH2) اوره مثبت باشد پروتئوس و پرویدنسیا

اسلاید 69: سرولوژی سرولوژی انتی سرم پلی والان  مونووالان O از کلنی موجود برروی TSIبرای اینکار استفاده کنید.سویه ای که با آنتی سرم پلی والان آگلوتیناسیون آنتی سرم مونووالانO آگلوتیناسیون بعنوان سالمونلا گزارش کنید.اگر با آنتی سرم پلی والان آگلوتینینه نشد ولی ازنظر بیوشیمیایی به سالمونلا تیفی می خورد باید با آنتی سرم Vi سرولوژی شود

اسلاید 70: توصیه هایی دررابطه با بررسی اولیه کشت مدفوع تشخیص نهایی سالمونلا و شیگلا تنها براساس تست های بیوشیمیایی یا تنها با سرولوژی نمی تواند صورت بگیرد.اگر تشخیص بیوشیمیایی وسرولوژی با آنتی سرم پلی والان انجام گیرد وسالمونلا یا شیگلا بودن سویه تائید شود. تعیین گونه وسروتیپ با آنتی سرمها صوررت گیرد.اگر بعضی سویه ها با آنتی سرم پلی والان آگلوتینه شود ولی ازنظر بیو شیمیایی نتایج گیج کننده بدهند.این سویه ممکن است :یک سویه نادر سالمونلا باشد.آریزونا سیتروباکتر باشد.این سویه ها باید به آزمایشگاه مرجع فرستاده شود.اگر یک سویه ازنظر بیوشیمیایی سالمونلا باشد و با آنتی سرم پلی والان آگلوتینه نشود. آزمایشات بیوشیمیایی بیشتری باید صورت گیرد. اگر همچنان سالمونلا باشد. سویه باید به آزمایشگاه مرجع فرستاده شود.

اسلاید 71:

اسلاید 72: تشخيص آزمايشگاهي شيگلا

اسلاید 73: شیگلاکلنی هاي شیگلا بر روي محیط مک کانکی کلنیهای بیرنگ یا همرنگ محیط روي محیطHE سبز یا آبی سبز (سبزتر از کلنی سالمونلا) بدون مرکز سیاه روي محیط XLD قرمز یا صورتی بدون مرکز سیاه می باشند

اسلاید 74:

اسلاید 75:

اسلاید 76: تشخیص بیو شیمیایی:کلنی هاي مشکوك به شیگلا را می توان روي محیط TSI یا KIA از نظر بیوشیمیایی و تعیین سروگروه، غربالگري نمود.اگر کلنی کاملاً ایزوله روي محیط وجود ندارد، می توانید از کلنی مشکوك برداشته روي پلیت دیگري Streak نموده تا کلنی هاي خالص بدست آید.در طی انکوباسیون محیطTSI باید در لوله یا پنبه آن براي تهویه شل باشد، در غیر اینصورت نتایج گمراه کننده اي بدست می آید.

اسلاید 77: سویه هاي شیگلا بر روي این دو محیط منظرهAlk/Acid بدون تولید گاز وH2S ایجاد میکنند.سویه هاي شیگلا سونئی لاکتوز را در انکوباسیون طولانی تخمیر می کنندقبل از آزمایشات تعیین سروگروه، از تستهاي بیوشیمیایی حرکت، اوره و لایزین دکربوکسیلاز که براي شیگلاها منفی هستند،استفاده کنید. باکتري هایی که با تستهاي فوق واکنشهاي مشکوك به شیگلا را ایجاد می کنند، باید با تستهاي بیوشیمیایی تشخیص داده شود و سپس با آنتی سرم تعیین سروگروه شوند

اسلاید 78:

اسلاید 79: a.Lactose fermentation 25%b.Lactose fermentation 15%باکتریاندولتخمیر قند لاکتوزتولید گاز گلوکزحرکتONPGE.coli+++++E.coliInactive+(-)a__(+)cE.Vulneris-(-)b+++c.ONPG 45%جدول تست های افتراقی تشخیصی E.coli

اسلاید 80: شیگلاها بر روي TSI , KIAبه طور مشخص واکنشAlk/Acid بدون تولید گاز و H2S تولید میکنند. اما بعضی از سویه هاي شیگلا فلکسنري سروتایپ6وسویه هاي نادري از شیگلا بوئیدي در این دو محیط گاز تولید می کنند.شیگلاها لاکتوز را تخمیر نمی کنند. اما شیگلا سونئی لاکتوز را در انکوباسیون طولانی (بیش از48 ساعت) تخمیر کرده و اسید تولید می کنند.شیگلا سونئی و 15 % از شیگلا دیسانتري ها( سروتایپ 1 )و 8% از شیگلا بوئیدي ها(سروتایپ9) ONPGمثبتند. سایر گونه هاي شیگلا ONPGمنفی میباشند.

اسلاید 81: تعیین سروگروهانجام آزمایش با آنتی سرم براي تشخیص شیگلاها ضروري است. جنس شیگلا داراي 4 سروگروه یا زیر گروه می باشد: S.dysenteriae (Serogroup A) , S. flexneri (Serogroup B) , S. boydii (Serogroup C), S. sonnei (Serogroup D)سروگروه یا زیرگروهA دارای 15 سرو تایپ، Bداراي 8 سروتایپ، C داراي 19 سروتایپ وD فقط داراي یک سرو تایپ میباشد.

اسلاید 82: تعیین سروگروه به وسیله آگلوتیناسیون بر روي لام با آنتی سرمهاي سوماتیکO شامل :,Poly C ,poly B ,poly A poly D انجام می شود.از آنتی سرمهاي مونووالان براي تشخیص اختصاصی سروتایپ ها استفاده میشود.تعیین سروتایپ در آزمایشگاه هاي مرجع امکان پذیر استسروتایپ 1 شیگلا دیسانتري همه گیریهای طولانی و شدید با مرگ و میر فراوان ایجاد می کند و شناسایی آن از اهمیت خاصی برخوردار است.

اسلاید 83: تمام سویه هایی که از نظر بیوشیمیایی به عنوان شیگلا تشخیص داده می شوند اما با آزمایش با آنتی سرم منفی هستند،باید براي تشخیص قطعی به آزمایشگاه مرکز بهداشت استان و از آنجا به آزمایشگاه همکار دانشکده بهداشت دانشگاه تهران یا انستیتو پاستور ارسال شوند.همه آنتی سرمها باید قبل از استفاده جهت اطمینان از واکنش هاي مورد انتظار مورد آزمون کنترل کیفی قرار گیرند. براي کنترل کیفی هر آنتی سرم باید از سوشهاي کنترل مثبت و منفی استفاده کرد. نتایج تمام واکنشها باید ثبت شود..-

اسلاید 84:

اسلاید 85: تشخيص آزمايشگاهي سالمونلا

اسلاید 86: مشخصات سالمونلا: باسیل گرم منفی بی هوازی اختیاریمتحرک (Salmonella enterica serovar gallinarum, Salmonella enterica serovar pullorum)تولید اسید و گاز از کربوهیدرات هااکسیداز و کاتالاز منفیتولید هیدروژن سولفایددکربوکسیلاسیون لیزین)

اسلاید 87: خصوصيات جنس سالمونلا دو گونه در جنس سالمونلا وجود دارد ::Salmonella enterica (6 sub species)Sal.enterica sub entericaSal enteriaca sb salamaeSal. enterica sub arizonaeSal. enterica sub diarizonaeSal. enterrica sub houtenaeSal.enterica sub indicaSalmonela bongori (sub spv)

اسلاید 88:

اسلاید 89: کشتکلنی سویه هاي سالمونلا بر روي محیطMAC بیرنگ یا همرنگ محیط، HEآبی یا سبز- آبی با مرکز سیاه وXLD قرمز با مرکزسیاه میباشند.

اسلاید 90:

اسلاید 91: Shigella on HE agar

اسلاید 92:

اسلاید 93: Salmonella on XLD agar1/14/2018Dr.M.Sharifi93

اسلاید 94: Salmonella (cont’d)Salmonella on MacConkey

اسلاید 95: تشخیص بیوشیمیاییکلنی هاي مشکوك به سالمونلارا می توان روي محیط TSI یا KIA از نظر بیوشیمیایی و تعیین سروگروه، غربالگري نمود.اگر کلنی کاملاً ایزوله روي محیط وجود ندارد، می توانید از کلنی مشکوك برداشته روي پلیت دیگري Streak نموده تا کلنی هاي خالص بدست آید. اکثر سویه هاي سالمونلا بر روي این دو محیط واکنش Alk/Acid , Gas+ , H2S+ایجاد می کنند. Salmonella Typhi واکنشAlk/Acid بدون تولید گاز و با مقدار کمH2S درخط تلقیح آنس ایجاد میکنند.سویه هاي سالمونلا به استثنايSalmonella ParatyphiA لایزین را دکربوکسیله کرده و اغلبH2S تولید میکنند.

اسلاید 96:

اسلاید 97:

اسلاید 98: سویه هایی که با تست غربالگري فوق واکنشهاي مشخص سالمونلا را ایجاد می کنند، باید با مجموعه اي از تستهاي بیوشیمیایی تشخیص داده شوند و با آنتی سرمهاي پلیO ، گروه A,B, C,D مورد آزمون آنتی سرمی قرار گیرند.این سویه ها باید براي تایید به آزمایشگاه مرکز بهداشت استان و 5٪ آن به آزمایشگاه همکار ،دانشکده بهداشت دانشگاه تهران یاانستیتوپاستورارسال شوند.

اسلاید 99: مشكلات تشخيصي سالمونلا (A-E) O عدم آگلوتيناسيون با آنتي سرموجودviوجود كلنيRough عدم تشخيص سالمونلا پاراتايفي A

اسلاید 100: تعیین سروگروهاستفاده از آنتی سرم در تشخیص سالمونلاها ضروري است. تعیین سروگروه به وسیله آگلوتیناسیون بر روي لام با آنتی سرمهاي O سوماتیکانجام می شود. آنتی سرمهاي پلیO مورد استفاده در تعیین سروگروه سالمونلا شامل آنتی سرمهاي گروهE تا A میباشد، زیرا حدود 95 ٪ از سویه هاي سالمونلا متعلق به این گروههاست. براي مثال سالمونلاتایفی و انتریتیدیس در سروگروهD ، کلراسوئیس و نیوپورت در سروگروه C ، تایفی موریوم در سروگروه B قرار دارند.

اسلاید 101: ازآنجاییکه آنتی سرم مورد استفاده در آزمایشگاههاي بهداشتی فقط آنتی سرمهاي پلیO است، پس از تعیین اولیه سروگروه ، سویه سالمونلا براي مراحل سروتایپینگ که نیاز به آنتی سرمهاي H , vi میباشدبه آزمایشگاه همکار دانشکده بهداشت دانشگاه تهران یا انستیتو پاستور ارسال میگردد.در مواجهه با موارد ذیل سویه باکتریایی مورد آزمون باید به آزمایشگاه مرکز بهداشت استان ارسال شود:اگر سویه مورد آزمون از نظر واکنشهاي بیو شیمیایی به طور مشخص شبیه سالمونلاها هستند، اما با آنتی سرمهاي سالمونلا آگلوتینه نمی دهند.اگر سویه مورد آزمون از نظر واکنشهاي بیوشیمیایی همه مشخصه هاي سالمونلا را ندارد، اما با آنتی سرمهاي ·Oسالمونلا آگلوتینه ایجاد میکند

اسلاید 102: 102با تشکر از توجه شما