DNA

صفحه 1:
cell free fetal DNA (cffDNA) or Non Invasive Prenatal Testing (NIPT) Dr. Sarang Younesi Nilou Medical Laboratory Tehran, Iran 

صفحه 2:
۱ S TOE SES OEE PSS UWS cn kote ‏مطرح شده‎ OO? Ju 5) (cfFDNA) است, 55 2 Y ‏کریهیزم‎ Ber ern ee ec en ‏و انلها‎ 

صفحه 3:
* منشاء 11101۸ از سلول‌های سیتوتروفوبلاست جفت بوده ‎(cfpDNA)‏ Cell- fr Fatal (CFF) DNA Ps apoptotic ‘trophoblast cells maternal DNA fragments etal DNA 

صفحه 4:
cell free ۳ 2۳ DNA (= DNA) ‎BU NWe- Toye ete eeE SY.) ۲ NAD coco a- ogi 1 5‏ ‎em‏ کر کر ‎OP PHT ETE 20‏ 0 ۳ عملکرد مختلفی دارند تشکیل می‌شوند: - یک مبری سلل‌ها جین را تشکیل می‌دهند. ی ۱۹۳0۵ ‎pea a eae‏ ا و ‎ ‎inner cell mass ‎cytotrophoblast ‎— syncytiotrophoblast ‎— endometrium 

صفحه 5:
مقدمه © 27 از کل1((۸ آزاد موجود در گردش خون مادر 1214م را تشكيل مىدهد ‎fetal fraction oJ 4: 4S)‏ ‎Er Yer)‏ ل ‎Der cared ee Rune‏ )11 0۳ بر عهده دارد) " در سه ماهة سوم باردارى اين نسبت به 0©- 700 افزايش ‎cfpDNA *‏ » هفتة م باردارى در خون مادر ظاهر و بلافاصله بعد از تولد نوزاد از كردش خون وى باك مىشود: طورى كه © ساعت بس از زايمان ديكر در خون مادر قابل ‎5300220 

صفحه 6:
Importance of fetal _____ fraction _ _ \ ie اا ۱ ۱1۳۲ cf{DNA Maternal rod LN 

صفحه 7:
"از نظر اندازه اين مولكول بسيار كوجكتر از ‎cimDNA‏ 2 5 ابعادى در حدود ‎SOD‏ - م143 (كمتر از 600 ‎Ady cal s Uo (bp‏ اساس بسيارى از تكنيكهاى افتراق 15271(117/44© از 22212114 را تشکیل می‌دهد. 

صفحه 8:
cfpDNA 2S ‎ *‏ تعیین اختلالات آنوپلوتیدی‌های شایع (كروموزوم 0©: 06 و 08) ‎210110010000000 wn) ‏و ‏ا 

صفحه 9:
cfpDNA ‏كاربرد‎ fer ‏و ار سا‎ Tae a ‏سردستة اين اختلالات عبارتند از:‎ ‏سندرم 26 شکننده»‎ - ‏ديستروفى عضلانى دوشن ((1(11/11) كه ناشى وجود نقص در ين ((191/11) واقع در كروموزوم‎ - XxX 32211 - سندرم ویسکات آلدریچ (محصول آن یعنی پرونتین ۷۷/۸5 که برروی تمام سلولهای خونی وجود دارد ی توجه: تعيين جنسيت براى بيكيرى بيماريهاى ديكر نظير 01720©61121© ا ا ‎Ayla‏ ۱ ‏ی‎ ‎۱ SEY ES Ete BES See Se nes ice ee eto) 0 SS ew Poe ES Save w lene es Leyes boi) 

صفحه 10:
۱ و جنين ‎torcer Ben‏ ال ا 0 كرد: " اين تست مى تواند در موارد زير توصيه شود: " زنان ©© سال يا بالاتر ۱ 0 " وجود يافتقاى در سونوكرافى كه نشان دهندة افزايش ريسك اختلالات آنوبلوئيدى ‎Ror)‏ Pe SP Sy eye ere ECE rt ie ‎eM aC) eee Tesh ree ree nE tii‏ ةا 12 در والدين كه سبب افزايش ريسك تريزومى ©0 و 0)© در جنین,می‌شود. ۱ " زنانيكه به هر دليلى تا ©© هفتكى تست هاى روتين غربالكرى را انجام نداده اند. 

صفحه 11:
۱ ravee PC OL0l CR (omen er errr NS BB Cet ap Nene ere Rtrn ra jr) DIY. Cet n ve Ror Coney) 39 CVS clo: ‏تشخيصى نبوده و جايكزينى‎ cipDNA cud ‏آمنيوسنتز محسوب نمىشود.‎ " قدرت تشخيص اين تست براى تريزومى ۰00 9 و 09 بيشتر از ‎hee)‏ ا 0 " در صورت مثبت شدن تستهء بيمار بايد براى مشاورة نتيك و انجام تستهاى تشخيصى (براى تائيد نتيجة اين تست) ارجاع داده شود. * اين تست قادر به تشخیص انواع مختلف سندرم داون نیست. (موزائیسم» آنوپلوئیدی جزثی کروموزومی و یا ترانسولوکاسیون) و ۱ مستقیماً برای انجام تست‌های تهاجمی تشخیصی ارجاع داده شود. 

صفحه 12:
۱ 21 Confined Placental Mosaisims -( * Vanishing twins - " Maternal Malignancy GreNtertY ery met Tots co ‏ع صمنادنزه‎ 0۲۷( ‎enews Sco NS Ie cael‏ 2 له - تخمک اهدایی» - تزریق خون طی 19 ماه گذشته ۱ ‎0 ee eee) koe ere tener ‏می شود.‎ 

صفحه 13:
False Positive (CPM) confined placental) ‏در مواقعی که موزائیسم جفتی‎ * POET Se Sore eon Te OSL ES SEC i Ceo) ‎IST SS See ere Pome pe Shee lewun il‏ ل سلول‌های تشکیل دهندة جفت دیده می‌شود» در حالی که سلول‌های دیگر از جمله سلول‌های جنین نرمال می‌باشند ‏ا ا ‎d Oh‏ ۱ آمنیوسنتز داریم. ‏* این حالت در 9602 بارداری‌ها دیده می‌شود و در نتيجه وضعیتی تقریبً شايع است. 

صفحه 14:
False Negative Rate rE ee ee ei Peet eens tee DW OCIA BE) ‏کاذب است و عبارتند از:‎ * 1 اگر تست قبل از هفته دهم حاملگی انجام شود امکان کسب نتیجه منفی کاذب به دلیل کاهش ۱ 9 ‏و‎ epee rere ry CORP Pee ir eas Oris sino ii RBI EY SK SEN r a i DT.Y ©- جنين ترييلوتيد: بدليل آنكه تمام كروموزوم ها سه تا شده اند اين تست در هنكام محاسبه نسبت کروموزوم 00 به کروموزوم های پایه این نسبت را 4 به 0 محاسبه و بعنوان جنین سالم كزارش مى كند. ا ال ل لل ‎Be evr ve‏ را جفت سالم است. 

صفحه 15:
The IONA® test Fast: results available in 3-5 working days Accurate: Smee LCRA ‏عصمناخدمی چصه‌کنتا‎ (trisomy 21, 18 and 13) - greater than 97% at detecting fetal sex and <1% false positive rate Local: the IONA® test is performed in a laboratory local to you, not shipped to US or China Quality: the IONA® test is a regulated screening test which is CE marked IVD The IONA‘® test is the first complete CE-IVD VRC CMC mn mA he artis house non-invasive prenatal testing (NIPT) service. کر ره و ۱۹۰۱۱۱۱۱۱ ‎through analwvcic‏ ۳۹| 

صفحه 16:


صفحه 17:
پروتکل پیشنهادی جهت غربالگری دوران پره ناتال * مطالعات مختلف نشان دهنده آن است: ل ‎Ee ee‏ ۱ کلیه اختلالات کروموزومی دارد " واز طرفئ ماركرهاى بيوشيميايى خون نيز ارزش زيادى در بيكيرى عوارض نامطلوب بازدارئ (نظير بره اكلامبسى؛ اختلال رشد داخل رحمىء زايمان زودرسء تولد ا ا ‎are NESE‏ ا ل ‎PSST eee Pe‏ شدید در هنگام زایمان طبیعی» دکولمان جفت و غیره) دارند (بنابراینبهتر تک که در تمامبیماران تست های غریالگری سنتی انجام شده و بر مبنای ‎VT Rin en aCe Mn On ne‏ cul cl a بالاترى براى تشخيص 

صفحه 18:
The Contingent NIPT Model Eanes 0 ۳ 1 5 7 (Preferred) y= eran ores 

صفحه 19:
۱9 ‏ا‎ <Epe ۶ ers Uy ner a 6600 )): يى 4178 با محاسبه ]/2/101 در هفته 06 تا 0 براى رد اختلالات طناب عصبى و ديواره شكمى و انجام آنومالى اسكن در هفته ‎Tce)‏ 0 

صفحه 20:
پروتکل پیگیری در غربالگری سه ماهه اول " حداقل 00 :322113 5018 اختلالات كروموزومى؛ جك شود: لوي ‎—High-level‏ ‎«Nasal Bone (LR = 6.6) -‏ عدم ءا عوائد 10721 1140 - ‎‘ASRA (Aberrant Right 3.9( -‏ - (3.8 د 08 الى ‎«Mild cerebral ventriculomegaly (LR = 3.8) -‏ ‎MidbawaW markers‏ - ‎‘Echogenic Bowel Focus (LR = 1.6) -‏ ‎dsolated mild pyelectasis (LR = 1.1) -‏ ‎‘Short humeral length -‏ ا 1۱ ‎‘Echogenic Intracardiac Focus -‏ ‎BeSieos contre Corts ae‏ ‘ ‎dsolated Choroid Plexus (LR = 7.0) -‏ 

صفحه 21:
۱9 ‏ا‎ <Epe IA (WSO GYY Ky) 5bd yo Sorgine p GALE Gye -O 1 Renny ES ERE Oe RTABT ‏در موارد ذیل می توان به اين گروه از افراد به جای تست های تشخیصی‎ * ‏نمود:‎ NIPT ‏توصیه به انجام‎ CDSN OCR er ns een tr eee DATs en iE Toe ‏زنانی که زیر بار ریسک سقط تست های تشخیصی نمی روند.‎ - ‏زنانی که سابقه سقط مکرر دارند. به شرط آنکه کاریوتایپ پدر و مادر نرمال باشد‎ - ۱ ete) ‏زنانی که 111۷ مثبت هستند.‎ - ‏زنانی که جفت پایین دارند»‎ - ‏زنانی که مالتیپل فیبروما دارند»‎ - ۱ ve Sr mene ۱ ‏و‎ ‎۱ ‏ا ا‎ Ett sro 

صفحه 22:
0 CTS. " جنين طلايى به موارد ذيل كفته مى شود: - جنینی که بعد از چندین سال ناباروری حاصل شده است» ‎Cpr‏ را ‎Frere Pe Pe cor‏ ‎E Cee‏ ل ‎(Ot) Are‏ 0 Pee (cas OTS DCO TEC OPO ent Ver enST a iy Pe SC SUPE NY Hod ME VOR IE VUE err eAlerts ger Sie CmCE ‏قدرت تشخيصض ©9©,؟ و مثبت كاذب 900 براى اختلالات كروموزومى به‎ rer See 

صفحه 23:
The Contingent NIPT Model 11 214 18 (Prefer ‏>اصاداصهععه)‎ Poe eae 

صفحه 24:
بروتكل بيكيرى در غربالكرى تركيبى (سكوئنشيال) " نحوه بيكيرى مانند مرحله دوم استء فقط ريسك ها: - کم خطر (کمتر از 0/0000)» ‎EE) reeras ae‏ ل ا“ " هر جند كه هنوز نيازمند مطالعات بالينى بيشتر جهت ارزيابى ارزش ميزان افزايش قدرت تشخيص تست نسبت به قيمت تمام شده اين بروتكل و همينطور جه مقدار از ساير اختلالات ‎ESE TB)‏ ال ‎Pee MR‏ 

صفحه 25:


cell free fetal DNA (cffDNA) or Non Invasive Prenatal Testing (NIPT) Dr. Sarang Younesi Nilou Medical Laboratory Tehran, Iran مقدمه ‏ ‏ بحث استفاده از DNAآزاد موجود در گردش خون مادری با منشاء جنینی ( )cffDNAاز س ال ،1997توسط Dennis Loمطرح شده است. متايي از ک روموزم Yجنين ي در س رم Dennis Loب ا ردياب ي ق س ‌ه آنوپلوئيديها در دوران ‌ روشهايغير ت هاجميت شخيص مادر ،زیر ب نایظهور ‌ ب ارداريش د. مقدمه از س لول‌های س یتوتروفوبالست جفت بودهcffDNA منشاء )cfpDNA( shedding of the placental microparticles into the( )maternal bloodstream   =( cell free placental DNA )cfpDNA دکتر مارک لیچ در سال 2013گزارش داد که در واقع DNAمورد بررسی در این روش DNA جنین نبوده بلکه DNAجفتی است ،بر اساس یافته های علم جنین شناسی گامت (تخمک) در الیة آندومتر النه‌گزینی و شروع به تقسیم سلولی می‌کند در اولین تقسیمات سلولی یک سری سلول‌های متفاوت که در آینده عملکرد مختلفی دارند تشکیل می‌شوند: یک سری سلول‌ها جنین را تشکیل می‌دهند. یک سری سلول‌ها در آینده جفت را تشکیل می دهند که به آنها سیتوتروفوبالست () Cytotrophoblastمی‌گویند. یک سری سلول‌ها هم مانند یک لنگر باعث اتصال جنین و جفت به جدار رحمی مادر می‌شوند که به آنها سلول‌های سنسیتیوتروفوبالست ( )Syncytiotrophoblastمی‌گویند. مقدمه ‏ 3٪ -13از کل DNAآزاد موجود در گردش خون مادر cfpDNAرا تشکیل می‌دهد (که به آن fetal fraction می گویند و نقش مهمی در صحت انجام تست های cfpDNAرا بر عهده دارد) ‏ در س ه ماه ة س وم بارداری ای ن نس بت ب ه ٪10 -20افزایش می‌یابد. ‏ cfpDNAدر هفت ة 7بارداری در خون مادر ظاهر و بالفاص له بع د از تولد نوزاد از گردش خون وی پاک می‌شود، طوری ک ه 2س اعت پ س از زایمان دیگ ر در خون مادر قابل Importance of fetal fraction Fetal Fetal Fraction Expected ratio for Trisomy cfDNA 4% 1.02 (96 x 2 + 4 x 3/200) 10% 1.05 (90 x 2 + 10 x 3/200) 20% 1.10 (80 x 2 + 20 x 3/200) 40% 1.20 (60 x 2 + 40 x 3/200) Maternal cfDNA Reference Chromosome Chromosome 21 مقدمه از نظ ر اندازه ای ن مولکول بس یار کوچک‌تر از cfmDNAبوده و ابعادی در حدود - 200 ( 143bpکمتر از )bp 200دارد و این ویژگی اس اس بسیاری از تکنیک‌های افتراق cfpDNAاز cfmDNAرا تشکیل می‌دهد. کاربرد cfpDNA ‏ -1تعیین اختالالت آنوپلوئیدی‌های شایع (کروموزوم 18 ،21و )13 ‏ -2تست‌های اختالالت تک ژنی ()SGM ‏ -3تشخی ص فاکتورهای آنت ی ژنی ک مربوط ب ه ناس ازگاری سیستم ‏RhD کاربرد cfpDNA ‏ -4تعیین جنسیت از نظر اختالالت ژنتیکی مرتبط با کروموزوم جنسی سردستة این اختالالت عبارتند از: سندرم Xشکننده، دیستروفی عضالنی دوشن ( )DMDکه ناشی وجود نقص در ژن ( )DMDواقع در کروموزوم،X هموفیلی، سندرم ویسکات آلدریچ (محصول آن یعنی پروتئین WASPکه برروی تمام سلولهای خونی وجود داردسنتز نشده و بیمار دچار میکرو ترومبوسایتوپنی و کاهش عملکرد فاگوسیتی گلبولهای سفید می شود) توج ه :تعیی ن جنس یت برای پیگیری بیماریهای دیگ ر نظیر Congenital ) Adrenal Hyperplasia (=CAHنیز اهمیت دارند. (به دلیل مهار تولید کورتیکواستروئیدها هورمون‌های آندروژن افزایش یافته و اگر جنین دختر باشد باعث مردانه شدن اندام تناسلی خارجی وی می گردد و در این موارد باید از هفتة 7بارداری درمان با دگزامتازون را برای جنین‌های دختر شروع کرد و مانع از ترشح آندروژن‌ها شد). طبق توصیة دسامبر ACOG 2015و انجمن طب مادر و جنین در هنگام توصیه تست ،cfpDNAباید به نکات ذیل نیز توجه کرد: ‏ این تست می تواند در موارد زیر توصیه شود: ‏ ‏ ‏ ‏ ‏ ‏ ‏ زنان 35سال یا باالتر وجود یک تست غربالگری مثبت (مانند تس ت‌های غربالگری سه ماهة اول ،دوم، اینتگریتد و یا سکوئنشیال) وجود یافتةای در سونوگرافی که نشان دهندة افزایش ریسک اختالالت آنوپلوئیدی است. وجود سابقة قبلی داشتن جنین و یا فرزند مبتال به تریزومی‌ وجود یک جابجایی متوازن رابرتسونی (Balanced Robertsonian )Translocationدر والدین که سبب افزایش ریسک تریزومی 13و 21 در جنین می‌شود. وجود سابقه خانوادگی داشتن تریزومی 18 ،21و 13 زنانیکه به هر دلیلی تا 22هفتگی تست های روتین غربالگری را انجام نداده اند. طبق توصیة دسامبر ACOG 2012و انجمن طب مادر و جنین در هنگام توصیه تست ،cfpDNAباید به نکات ذیل نیز توجه کرد: ‏ ‏ ‏ ‏ ‏ تس ت cfpDNAتشخیص ی نبوده و جایگزینی برای CVSو آمنیوسنتز محسوب نمی‌شود. قدرت تشخی ص ای ن تس ت برای تریزوم ی 18 ،21و 13بیشتر از %99است (منفی و مثبت کاذب کمتر از .) ٪1 در صورت مثبت شدن تست ،بیمار بای د برای مشاورة ژنتیک و انجام تست‌های تشخیصی (برای تائید نتیجة این تست) ارجاع داده شود. این تست قادر به تشخیص انواع مختلف سندرم داون نیست. (موزائیسم ،آنوپلوئیدی جزئی کروموزومی و یا ترانسولوکاسیون) در صورت مشاهده آنومالی ساختاری در سونوگرافی جنین ،باید بیمار مستقیما ً برای انجام تست‌های تهاجمی تشخیصی ارجاع داده شود. False Positive Rate ‏ ‏ ‏ ‏Confined Placental Mosaisims -1 ‏Vanishing twins -2 ‏Maternal Malignancy (maternal copy number -3 )variation = CNV ‏ -4از علل دیگر مثبت کاذب مواردی مثل: تخمک اهدایی، تزریق خون طی 12ماه گذشته -پیوند مغز استخوان سه منشاء کروموزومی ( 21مادری ،جنینی و تخمک و یا خون اهدایی) سبب مثبت کاذب شدن تست می شود. )False Positive (CPM ‏ در مواقع ی ک ه موزائیس م جفتی (confined placental )mosaicismوجود دارد امکان کسب نتیجة مثبت کاذب وجود دارد. ‏ ای ن حال ت زمان ی ایجاد می‌شود ک ه س ه‌تایی شدن کروموزوم در بعضی سلول‌های تشکی ل دهندة جف ت دیده می‌شود ،در حالی که سلول‌های دیگر از جمله سلول‌های جنین نرمال می‌باشند ‏ شبیه مشکلی که در CVSدیده می‌شود و در نتیجه برای تأئید تشخیص نیاز به آمنیوسنتز داریم. ‏ ای ن حالت در %1-2بارداری‌ه ا دیده می‌شود و در نتیج ه وضعیتی تقریبا ً شایع است. False Negative Rate مواردی که منجر به کسب نتیجه منفی کاذب می شود خیلی کمتر از موارد مثبت کاذب است و عبارتند از: ‏ - 1اگر تست قبل از هفته دهم حاملگی انجام شود امکان کسب نتیجه منفی کاذب به دلیل کاهش fetal fractionوجود دارد. ‏ - 2اگر برای زنان بسیار چاق انجام شود امکان کسب نتیجه منفی کاذب به دلیل کم بودن مقدار cffDNAبدلیل فاکتور رقت وجود دارد. ‏ - 3جنین تریپلوئید :بدلیل آنکه تمام کروموزوم ها سه تا شده اند این تست در هنگام محاسبه نسبت کروموزوم 21به کروموزوم های پایه این نسبت را 1به 1محاسبه و بعنوان جنین سالم گزارش می کند. ‏ -4موزائیسم واقعی جنینی ( :)true fetal mosaicismدر این موارد بعضی از بافت های جنین به صورت موزائیسم شامل سلولهای نرمال و هم آنوپلوئید می باشد در حالیکه جفت سالم است. The IONA® test   Fast: results available in 3-5 working days Accurate: - greater than 99% at detecting trisomy conditions (trisomy 21, 18 and 13) - greater than 97% at detecting fetal sex and <1% false positive rate     Local: the IONA® test is performed in a laboratory local to you, not shipped to US or China Quality: the IONA® test is a regulated screening test which is CE marked IVD The IONA® test is the first complete CE-IVD product for labs wishing to offer their own inhouse non-invasive prenatal testing (NIPT) service. Fully automated, standardised workflow from پروتکل پیشنهادی جهت غربالگری دوران پره ناتال ‏ مطالعات مختلف نشان دهنده آن است: ‏ تس ت های غربالگری سنتی نظیر س کوئنشیال قدرت تشخی ص باالتری برای تشخیص کلیه اختالالت کروموزومی دارد ‏ و از طرف ی مارکرهای بیوشیمیای ی خون نیز ارزش زیادی در پیگیری عوارض نامطلوب بارداری (نظیر پره اکالمپسی ،اختالل رشد داخل رحمی ،زایمان زودرس ،تولد نوزاد با وزن کم ،سقط زودهنگام ،جفت چسبنده ،پارگی زود هنگام کیسه آب ،خونریزی شدید در هنگام زایمان طبیعی ،دکولمان جفت و غیره) دارند (بنابراین بهتر است که در تمام بیماران تست های غربالگری سنتی انجام شده و بر مبنای جواب این تست ها بیماران به سه گروه کم خطر ،خطر بینابین و پرخطر قرار گرفته) ال پروتکل پیگیری در غربالگری سه ماهه اول ‏ جواب غربالگری س ه ماه ه اول در منطق ه ک م خط ر (ریس ک کمتر از ،)1/2500یک AFPبا محاسبه MoMدر هفته 15تا 17برای رد اختالالت طناب عصبی و دیواره شکمی و انجام آنومالی اسکن در هفته 18تا 20درخواست شود. پروتکل پیگیری در غربالگری سه ماهه اول : چک شود، اختالالت کروموزومیSoft marker 10 حداقل  - High-level markers ،Nasal Bone (LR = 6.6) - - Mid-level markers ،ASRA (َAberrant Right Subclavian) (LR = 3.9) ،NF (LR = 3.8) ،Mild cerebral ventriculomegaly (LR = 3.8) - MidLow-level markers ،Echogenic Bowel Focus (LR = 1.6) ،Isolated mild pyelectasis (LR = 1.1) ،Short humeral length ،Absent mid-phalanx of the fifth digit ،Echogenic Intracardiac Focus ، - Short Femur length  ،Isolated Choroid Plexus (LR = 7.0) -  پروتکل پیگیری در غربالگری سه ماهه اول ‏ ‏ -3جواب غربالگری در محدوده گروه پرخطر (ریسک باالی )1/50قرار گیرد ،توصیه به انجام تست های تشخیصی شود. در موارد ذیل می توان به این گروه از افراد به جای تست های تشخیصی توصیه به انجام NIPTنمود: زنانی که وحشت زیادی از نمونه گیری تستهای تشخیصی مثل آمنیوسنتز و یا CVSدارند، زنانی که زیر بار ریسک سقط تست های تشخیصی نمی روند، زنانی که سابقه سقط مکرر دارند ،به شرط آنکه کاریوتایپ پدر و مادر نرمال باشد(علت سقط مکرر اختالالت کروموزومی نباشد)، زنانی که HIVمثبت هستند، زنانی که جفت پایین دارند، زنانی که مالتیپل فیبروما دارند، زنانی که سابقه پارگی کیسه آب ( )PROMدارند، مواردی که کشت آمنیوسیتها موفقیت آمیز نمی باشد، -مواردی که با یک جنین طالیی مواجه شده ایم. پروتکل پیگیری در غربالگری سه ماهه اول ‏ جنین طالیی به موارد ذیل گفته می شود: جنینی که بعد از چندین سال ناباروری حاصل شده است، جنینی که از والدین با سن خیلی باال حاصل شده است، -جنینی که حاصل بارداری مصنوعی مثل IVFو یا ICSIمی باشد. ‏ بر همین اساس طبق مطالعه دکتر کاگان و همکاران در سال ،2014اعالم نمودند که ترکیب تست غربالگری سه ماهة اول و NIPTبا یکدیگر ،با قدرت تشخیص %98و مثبت کاذب %1برای اختالالت کروموزومی به همراه خواهد بود. پروتکل پیگیری در غربالگری ترکیبی (سکوئنشیال) ‏ نحوه پیگیری مانند مرحله دوم است ،فقط ریسک ها: کم خطر (کمتر از ،)1/1000 خطر بینابین (بین 1/101تا )1/1000 -پر خطر (بیشتر از )1/100 ‏ هر چند که هنوز نیازمند مطالعات بالینی بیشتر جهت ارزیابی ارزش میزان افزایش قدرت تشخیص تست نسبت به قیمت تمام شده ای ن پروتک ل و همینطور چ ه مقدار از سایر اختالالت کروموزومی با این پروتکل قابل تشخیص می باشد ،هستیم.