DNA

DNA

اسلاید 1: cell free fetal DNA (cffDNA) or Non Invasive Prenatal Testing (NIPT) Dr. Sarang YounesiNilou Medical Laboratory Tehran, Iran

اسلاید 2: مقدمهبحث استفاده از DNA آزاد موجود در گردش خون مادری با منشاء جنینی (cffDNA) از سال 1997، توسط Dennis Lo مطرح شده است. Dennis Lo با رديابي قسمت‌هايي از کروموزم Y جنيني در سرم مادر، زیر بنای ظهور روش‌هاي غير تهاجمي تشخيص آنوپلوئيدي‌ها در دوران بارداري شد.

اسلاید 3: مقدمهمنشاء cffDNA از سلول‌های سیتوتروفوبلاست جفت بوده (cfpDNA)(shedding of the placental microparticles into the maternal bloodstream)

اسلاید 4: cell free placental DNA (= cfpDNA)دکتر مارک لیچ در سال 2013 گزارش داد که در واقع DNA مورد بررسی در این روش DNA جنین نبوده بلکه DNA جفتی است، بر اساس یافته های علم جنین شناسی گامت (تخمک) در لایة آندومتر لانه‌گزینی و شروع به تقسیم سلولی می‌کند در اولین تقسیمات سلولی یک سری سلول‌های متفاوت که در آینده عملکرد مختلفی دارند تشکیل می‌شوند: - یک سری سلول‌ها جنین را تشکیل می‌دهند. - یک سری سلول‌ها در آینده جفت را تشکیل می دهند که به آنها سیتوتروفوبلاست (Cytotrophoblast ) می‌گویند. - یک سری سلول‌ها هم مانند یک لنگر باعث اتصال جنین و جفت به جدار رحمی مادر می‌شوند که به آنها سلول‌های سن سیتیوتروفوبلاست (Syncytiotrophoblast) می‌گویند.

اسلاید 5: مقدمه 13- 3٪ از کلDNA آزاد موجود در گردش خون مادر cfpDNA را تشکیل می‌دهد (که به آن fetal fraction می گویند و نقش مهمی در صحت انجام تست های cfpDNA را بر عهده دارد)در سه ماهة سوم بارداری این نسبت به 20- 10٪ افزایش می‌یابد. cfpDNA در هفتة 7 بارداری در خون مادر ظاهر و بلافاصله بعد از تولد نوزاد از گردش خون وی پاک می‌شود، طوری که 2 ساعت پس از زایمان دیگر در خون مادر قابل تشخیص نیست.

اسلاید 6: Importance of fetal fractionFetal FractionExpected ratio for Trisomy4%1.02 (96 x 2 + 4 x 3/200)10%1.05 (90 x 2 + 10 x 3/200)20%1.10 (80 x 2 + 20 x 3/200)40%1.20 (60 x 2 + 40 x 3/200)Chromosome 21Reference ChromosomeFetal cfDNAMaternalcfDNA6

اسلاید 7: مقدمهاز نظر اندازه این مولکول بسیار کوچک‌تر از cfmDNA بوده و ابعادی در حدود 200 - 143bp (کمتر از 200 bp) دارد و این ویژگی اساس بسیاری از تکنیک‌های افتراق cfpDNA از cfmDNA را تشکیل می‌دهد.

اسلاید 8: کاربرد cfpDNA1- تعیین اختلالات آنوپلوئیدی‌های شایع(کروموزوم 21، 18 و 13)2- تست‌های اختلالات تک ژنی (SGM)3- تشخیص فاکتورهای آنتی ژنیک مربوط به ناسازگاری سیستم RhD

اسلاید 9: کاربرد cfpDNA4- تعیین جنسیت از نظر اختلالات ژنتیکی مرتبط با کروموزوم جنسی سردستة این اختلالات عبارتند از: - سندرم X شکننده، - دیستروفی عضلانی دوشن (DMD) که ناشی وجود نقص در ژن (DMD) واقع در کروموزوم X ، - هموفیلی، - سندرم ویسکات آلدریچ (محصول آن یعنی پروتئین WASP که برروی تمام سلولهای خونی وجود دارد سنتز نشده و بیمار دچار میکرو ترومبوسایتوپنی و کاهش عملکرد فاگوسیتی گلبولهای سفید می شود) توجه: تعیین جنسیت برای پیگیری بیماریهای دیگر نظیر Congenital Adrenal Hyperplasia (=CAH) نیز اهمیت دارند. (به دلیل مهار تولید کورتیکواستروئیدها هورمون‌های آندروژن افزایش یافته و اگر جنین دختر باشد باعث مردانه شدن اندام تناسلی خارجی وی می گردد و در این موارد باید از هفتة 7 بارداری درمان با دگزامتازون را برای جنین‌های دختر شروع کرد و مانع از ترشح آندروژن‌ها شد).

اسلاید 10: طبق توصیة دسامبر 2015 ACOG و انجمن طب مادر و جنین در هنگام توصیه تست cfpDNA، باید به نکات ذیل نیز توجه کرد: این تست می تواند در موارد زیر توصیه شود:زنان 35 سال یا بالاتروجود یک تست غربالگری مثبت (مانند تست‌های غربالگری سه ماهة اول، دوم، اینتگریتد و یا سکوئنشیال)وجود یافتةای در سونوگرافی که نشان دهندة افزایش ریسک اختلالات آنوپلوئیدی است.وجود سابقة قبلی داشتن جنین و یا فرزند مبتلا به تریزومی‌وجود یک جابجایی متوازن رابرتسونی (Balanced Robertsonian Translocation) در والدین که سبب افزایش ریسک تریزومی 13 و 21 در جنین می‌شود. وجود سابقه خانوادگی داشتن تریزومی 21، 18 و 13 زنانیکه به هر دلیلی تا 22 هفتگی تست های روتین غربالگری را انجام نداده اند.

اسلاید 11: طبق توصیة دسامبر 2012 ACOG و انجمن طب مادر و جنین در هنگام توصیه تست cfpDNA، باید به نکات ذیل نیز توجه کرد: تست cfpDNA تشخیصی نبوده و جایگزینی برای CVS و آمنیوسنتز محسوب نمی‌شود.قدرت تشخیص این تست برای تریزومی 21، 18 و 13 بیشتر از 99% است (منفی و مثبت کاذب کمتر از 1٪ ). در صورت مثبت شدن تست، بیمار باید برای مشاورة ژنتیک و انجام تست‌های تشخیصی (برای تائید نتیجة این تست) ارجاع داده شود.این تست قادر به تشخیص انواع مختلف سندرم داون نیست. (موزائیسم، آنوپلوئیدی جزئی کروموزومی و یا ترانسولوکاسیون)در صورت مشاهده آنومالی ساختاری در سونوگرافی جنین، باید بیمار مستقیماً برای انجام تست‌های تهاجمی تشخیصی ارجاع داده شود.

اسلاید 12: False Positive Rate1- Confined Placental Mosaisims2- Vanishing twins3- Maternal Malignancy (maternal copy number variation = CNV)4- از علل دیگر مثبت کاذب مواردی مثل: - تخمک اهدایی، - تزریق خون طی 12 ماه گذشته - پیوند مغز استخوان سه منشاء کروموزومی 21 (مادری، جنینی و تخمک و یا خون اهدایی) سبب مثبت کاذب شدن تست می شود.

اسلاید 13: False Positive (CPM)در مواقعی که موزائیسم جفتی (confined placental mosaicism) وجود دارد امکان کسب نتیجة مثبت کاذب وجود دارد. این حالت زمانی ایجاد می‌شود که سه‌تایی شدن کروموزوم در بعضی سلول‌های تشکیل دهندة جفت دیده می‌شود، در حالی که سلول‌های دیگر از جمله سلول‌های جنین نرمال می‌باشندشبیه مشکلی که در CVS دیده می‌شود و در نتیجه برای تأئید تشخیص نیاز به آمنیوسنتز داریم. این حالت در 2-1% بارداری‌ها دیده می‌شود و در نتیجه وضعیتی تقریباً شایع است.

اسلاید 14: False Negative Rateمواردی که منجر به کسب نتیجه منفی کاذب می شود خیلی کمتر از موارد مثبت کاذب است و عبارتند از:1- اگر تست قبل از هفته دهم حاملگی انجام شود امکان کسب نتیجه منفی کاذب به دلیل کاهش fetal fraction وجود دارد. 2- اگر برای زنان بسیار چاق انجام شود امکان کسب نتیجه منفی کاذب به دلیل کم بودن مقدار cffDNA بدلیل فاکتور رقت وجود دارد. 3- جنین تریپلوئید: بدلیل آنکه تمام کروموزوم ها سه تا شده اند این تست در هنگام محاسبه نسبت کروموزوم 21 به کروموزوم های پایه این نسبت را 1 به 1 محاسبه و بعنوان جنین سالم گزارش می کند.4- موزائیسم واقعی جنینی (true fetal mosaicism): در این موارد بعضی از بافت های جنین به صورت موزائیسم شامل سلولهای نرمال و هم آنوپلوئید می باشد در حالیکه جفت سالم است.

اسلاید 15: The IONA® test Fast: results available in 3-5 working daysAccurate: - greater than 99% at detecting trisomy conditions (trisomy 21, 18 and 13) - greater than 97% at detecting fetal sex  and <1% false positive rateLocal: the IONA® test is performed in a laboratory local to you, not shipped to US or ChinaQuality: the IONA® test is a regulated screening test which is CE marked IVDThe IONA® test is the first complete CE-IVD product for labs wishing to offer their own in-house non-invasive prenatal testing (NIPT) service. Fully automated, standardised workflow from extraction through analysisSuitable for singleton, IVF and surrogate pregnancies

اسلاید 16:

اسلاید 17: پروتکل پیشنهادی جهت غربالگری دوران پره ناتالمطالعات مختلف نشان دهنده آن است: تست های غربالگری سنتی نظیر سکوئنشیال قدرت تشخیص بالاتری برای تشخیص کلیه اختلالات کروموزومی دارد و از طرفی مارکرهای بیوشیمیایی خون نیز ارزش زیادی در پیگیری عوارض نامطلوب بارداری (نظیر پره اکلامپسی، اختلال رشد داخل رحمی، زایمان زودرس، تولد نوزاد با وزن کم، سقط زودهنگام، جفت چسبنده، پارگی زود هنگام کیسه آب، خونریزی شدید در هنگام زایمان طبیعی، دکولمان جفت و غیره) دارند (بنابراین بهتر است که در تمام بیماران تست های غربالگری سنتی انجام شده و بر مبنای جواب این تست ها بیماران به سه گروه کم خطر، خطر بینابین و پرخطر قرار گرفته)

اسلاید 18: ال

اسلاید 19: پروتکل پیگیری در غربالگری سه ماهه اولجواب غربالگری سه ماهه اول در منطقه کم خطر (ریسک کمتر از 1/2500)، یک AFP با محاسبه MoM در هفته 15 تا 17 برای رد اختلالات طناب عصبی و دیواره شکمی و انجام آنومالی اسکن در هفته 18 تا 20 درخواست شود.

اسلاید 20: پروتکل پیگیری در غربالگری سه ماهه اولحداقل 10 Soft marker اختلالات کروموزومی، چک شود: High-level markers - - Nasal Bone (LR = 6.6)، Mid-level markers - - ASRA (َAberrant Right Subclavian) (LR = 3.9)، - NF (LR = 3.8)، - Mild cerebral ventriculomegaly (LR = 3.8)، MidLow-level markers - - Echogenic Bowel Focus (LR = 1.6)، - Isolated mild pyelectasis (LR = 1.1)، - Short humeral length، - Absent mid-phalanx of the fifth digit، - Echogenic Intracardiac Focus، Short Femur length - ،- Isolated Choroid Plexus (LR = 7.0)،

اسلاید 21: پروتکل پیگیری در غربالگری سه ماهه اول3- جواب غربالگری در محدوده گروه پرخطر (ریسک بالای 1/50) قرار گیرد، توصیه به انجام تست های تشخیصی شود. در موارد ذیل می توان به این گروه از افراد به جای تست های تشخیصی توصیه به انجام NIPT نمود: - زنانی که وحشت زیادی از نمونه گیری تستهای تشخیصی مثل آمنیوسنتز و یا CVS دارند، - زنانی که زیر بار ریسک سقط تست های تشخیصی نمی روند، - زنانی که سابقه سقط مکرر دارند، به شرط آنکه کاریوتایپ پدر و مادر نرمال باشد (علت سقط مکرر اختلالات کروموزومی نباشد)، - زنانی که HIV مثبت هستند، - زنانی که جفت پایین دارند، - زنانی که مالتیپل فیبروما دارند، - زنانی که سابقه پارگی کیسه آب (PROM) دارند، - مواردی که کشت آمنیوسیتها موفقیت آمیز نمی باشد، - مواردی که با یک جنین طلایی مواجه شده ایم.

اسلاید 22: پروتکل پیگیری در غربالگری سه ماهه اولجنین طلایی به موارد ذیل گفته می شود: - جنینی که بعد از چندین سال ناباروری حاصل شده است، - جنینی که از والدین با سن خیلی بالا حاصل شده است، - جنینی که حاصل بارداری مصنوعی مثل IVF و یا ICSI می باشد.بر همین اساس طبق مطالعه دکتر کاگان و همکاران در سال 2014، اعلام نمودند که ترکیب تست غربالگری سه ماهة اول و NIPT با یکدیگر، با قدرت تشخیص 98% و مثبت کاذب 1% برای اختلالات کروموزومی به همراه خواهد بود.

اسلاید 23:

اسلاید 24: پروتکل پیگیری در غربالگری ترکیبی (سکوئنشیال) نحوه پیگیری مانند مرحله دوم است، فقط ریسک ها: - کم خطر (کمتر از 1/1000)، - خطر بینابین (بین 1/101 تا 1/1000) - پر خطر (بیشتر از 1/100)هر چند که هنوز نیازمند مطالعات بالینی بیشتر جهت ارزیابی ارزش میزان افزایش قدرت تشخیص تست نسبت به قیمت تمام شده این پروتکل و همینطور چه مقدار از سایر اختلالات کروموزومی با این پروتکل قابل تشخیص می باشد، هستیم.