مراحل تشخیص آزمایشگاهی بیماری

مراحل تشخیص آزمایشگاهی بیماری

اسلاید 1: دکتر فرشته شاهچراغی دانشیار-عضو هیأت علمی انستیتو پاستور ایران مدیر گروه بخش میکروب شناسی مسئول فنی آزمایشگاه مرجع کشوری سیاه سرفه

اسلاید 2: What is Pertussis (Whooping cough) Highly contagious respiratory infection caused by Bordetella pertussis Outbreaks first described in 16th century Pertussis is a world wide diseaseBordetella pertussis is an exclusively human pathogenDramatic for neonates and infants but can be very severe for children and adults.

اسلاید 3: Pertussis remains one of the top 10 causes of death in children under 1 years old worldwide10 million cases worldwide400,000 deaths worldwide 90% in developing countries and mostly in infants

اسلاید 4: Case fatality ratesDeveloping countries 1 - 2% (important problem) Developed countries 0.04% (re-emerging problem France, USA, Sweden, Japan, England, Netherland, Canada Pertussis—as a re-emerging infection

اسلاید 5: Pertussis incidence in US

اسلاید 6: Duration of protection and waning immunity following infection and vaccinationIncomplete protection from vaccinationInfection source for infantsInfection source for adolescentsStrain polymorphismIncreased diagnosis and reporting.Resurgence of Pertussis

اسلاید 7:

اسلاید 8: Cause of pertussis? Gram negative coccobacillus (Bordetella pertussis) Isolated in 1906 Obligate aerobeNon-motileoptimal growth at 35-37 °С with humidityFastidiousNo growth on routine blood agarCatalse and Oxidase positiveSlow growing, requires 3-10 days of culture for identificationMedia: Bordet-GengouRegan-loweColony: smooth, tiny, glistening Appearance = “mercury-drop” or “pearl”

اسلاید 9: Bordetella spp.B. pertussis, Bordet and Gengou(1900)B. parapertussis, Bradford and Slavin (1937) B.bronchiseptica, Ferry:1910 B. holmesiiB. avium B. HinziiB. TrematumB.petrii

اسلاید 10: AdhesionsToxines B. pertussis virulence factors

اسلاید 11: Pertussis Vaccine1st Pertussis vaccine- whole cell (1940s)Acellular vaccine (PT, FHA, PRN, FIM)Combination vaccines

اسلاید 12: PathogenesisInflammation in respiratory tract Attack to lymphocytes of immune system

اسلاید 13: 47% Mom or DadMom32%Dad15%Sibling20%Grandparent8%Other25%20% sibling25% Others75% transmitted from close contacts8% grandparents

اسلاید 14:

اسلاید 15: Vaccination of childrenTreatment by azithromycine and erythromycine 50 mg/kg in 10 daysSampling of other persons contact to patientsDaily control of the family of patientsPrevention

اسلاید 16: What affects the clinical presentation of pertussis?AgeAdults and older children are less likely to have typical symptoms—eg, simple coughVery young infants might present atypically—eg, with apnoea alone—and not coughPrevious infectionSubsequent infections are milderPrevious vaccinationTime since previous vaccination or infectionLonger time, increased severity of infectionCo-infection

اسلاید 17: Symptoms ………………… less typicalDuration of cough……….. 36-48 daysAccompanied……………. Other symptoms pool of frequently undiagnosed pertussis cases ……….. Reservoir in very young patients Pertussis in adults and adolescents

اسلاید 18: Laboratory diagnosis

اسلاید 19: مراحل تشخيص آزمايشگاهي بيماريكشتسرولوژيPCRتشخيص آزمايشگاهيایمونوفلورسنت

اسلاید 20: اهمیت نمونه برداریکیفیت نمونه بستگی دارد به: جدی گرفتن از سوی پرسنل استفاده از دستورالعملهای مناسب و دقیق در استفاده از مواد و محیطهای تراسپورت رعایت زمان مناسب در انتقال نمونه به آزمایشگاهSpecimens of bacterial culture must not be stored for more than 24 hours prior to sending laboratory.

اسلاید 21: مقدمات نمونه گيري از بیمار نمونه گيري از طريق پزشك مربوطه صورت مي گيرد آماده كردن بيمار با توضيح در خصوص نمونه گيري كامل كردن پرسش نامه آماده كردن دستكش و ماسک و دو محیط ترانسپورت و دو عدد سواب داكرون (از سواب پنبه ای نمی توان استفاده کرد) محيط ترانسپورت رگان- لوحاوی سفالکسین (به صورت در بسته تا دو ماه در یخچال می توان نگه داشت)

اسلاید 22: نمونه گيري از بیمار از کجا باید انجام شود؟نازوفارنکس نازال خلط (بزرگسالان)

اسلاید 23: سواب را به انتهايي ترين بخش بيني برده و چند لحظه نگه مي داريم تا ترشحات به آن جذب شود و بلافاصله به محيط ترانسپورت انتقال داده مي شود. در مورد نوزادان در صورت عدم موفقیت در نمونه گیری از نازوفارنکس یا نازال پليت حاوي محيط كشت (برده- ژانگو) را 3 بار جلو دهان كودك در هنگام سرفه شديد نگه مي داريم. (cough plate)اين محيط ابتدا بايد 24 ساعت در دماي C°37 انكوبه شده سپس به آزمايشگاه ارسال گردد.نحوه نمونه گيري از بیمار

اسلاید 24: نمونه های موردنظر بایستی شرایط ذیل را دارا باشند:حتما نمونه های مورد نظردرمحیط ترانسپورت سیاه سرفه (Regan-Lowe Agar) رگان لوآگارحمل گردند.برای حفظ رطوبت محیط ترانسپورت، نمونه ها باید درکیسه فریزر که حاوی پنبه نم دار باشد حمل گردند.همراه با سرم و نمونه شرح حال بیمار نیز الزامی استنمونه بیمار در زنجیره سرد نگهداری و حمل گردد. نمونه گیری با سواب داکرون انجام شود. ( زیرا سواب مورد نظر توکسیک نبوده ورطوبت لازم برای بقای باکتری را دارا می باشد).

اسلاید 25: شرايط نگهداري نمونه سياه سرفه گرفته شده از بيمار در صورتی که ارسال نمونه ها بلافاصله پس از نمونه گیری انجام شود (فاصله زمانی 4 ساعت ارسال به آزمایشگاه) نمونه هاي جمع آوري شده را می توان در دمای محیط نگهداری و در داخل ظرف درب دار حاوی پنبه نم دار انتقال داد. در صورت ارسال نمونه ها حداكثر طي2 روز (48 ساعت) به آزمایشگاه، نمونه های جمع آوری شده در محیط ترانسپورت باید در یخچال نگهداری شده و در زنجیره سرد ارسال گردند. در این صورت بايد با پارافيلم درب لوله ها را كاملا محكم كرد و دور آنها را پنبه يا ابر نرم پيچيد و اين مجموعه را در داخل يك نايلكس حاوي پنبه مرطوب قرار داد و پرسشنامه تكميل شده را همراه با نمونه در داخل ظرف درب دار ديگري قرار داده و درب ظرف را كاملا بست. پس از چسب زدن درب آن، هر چه سريعتر نمونه ها را به آزمایشگاه مرجع ارسال نمود. اگر تاخیر در ارسال نمونه بیش از 48 ساعت باشد جهت انتقال نمونه ابتدا باید نمونه های جمع آوری شده در محیط ترانسپورت در دمایC ˚35 به مدت 2 روز انکوبه گردد و سپس در زنجیره سرد انتقال یابد.

اسلاید 26: فرم ارسال نمونه های مشكوك به سياه سرفهفرم ارسال نمونه های مشكوك به سياه سرفهفرم ارسال نمونه های مشكوك به سياه سرفهفرم ارسال نمونه های مشكوك به سياه سرفهنام استان: نام بيمارستان, دانشگاه, آزمايشگاه:نام بيمارستان, دانشگاه, آزمايشگاه:شماره تلفن : فاكس:تاريخ اعلام بيماري به مركز بهداشت استان:تاريخ اعلام بيماري به مركز بهداشت استان:تاريخ اعلام بيماري به مركز بهداشت استان:نام پزشك معالج:نام و نام خانوادگي بيمار:جنسيت: مرد زنجنسيت: مرد زنتاريخ تولد: روز ماه سالتاريخچه بيماريتاريخ شروع بيماري: روز ماه سالتاريخ شروع بيماري: روز ماه سالتاريخ شروع بيماري: روز ماه سالعلائم:- سرفه هاي قطاري و ادامه دار : بله  خير نامشخص - حالت تهوع همراه با سرفه: بله خير نامشخص - بيمار تب دارد: بله خير نامشخص علائم:- سرفه هاي قطاري و ادامه دار : بله  خير نامشخص - حالت تهوع همراه با سرفه: بله خير نامشخص - بيمار تب دارد: بله خير نامشخص علائم:- سرفه هاي قطاري و ادامه دار : بله  خير نامشخص - حالت تهوع همراه با سرفه: بله خير نامشخص - بيمار تب دارد: بله خير نامشخص علائم:- سرفه هاي قطاري و ادامه دار : بله  خير نامشخص - حالت تهوع همراه با سرفه: بله خير نامشخص - بيمار تب دارد: بله خير نامشخص - آنتي بيوتيك مصرف كرده است؟ بله  خير- نام دارو: زمان مصرف : از روز ماه سال- آنتي بيوتيك مصرف كرده است؟ بله  خير- نام دارو: زمان مصرف : از روز ماه سال- آنتي بيوتيك مصرف كرده است؟ بله  خير- نام دارو: زمان مصرف : از روز ماه سال- آنتي بيوتيك مصرف كرده است؟ بله  خير- نام دارو: زمان مصرف : از روز ماه سالواكسيناسيون قبلي (ديفتري-كزاز-خردسالان)-(ديفتري-كزاز بزرگسالان)- (ديفتري-كزاز-سياه سرفه) بله  خيرتاريخ آخرين دز: روز ماه سالواكسيناسيون قبلي (ديفتري-كزاز-خردسالان)-(ديفتري-كزاز بزرگسالان)- (ديفتري-كزاز-سياه سرفه) بله  خيرتاريخ آخرين دز: روز ماه سالواكسيناسيون قبلي (ديفتري-كزاز-خردسالان)-(ديفتري-كزاز بزرگسالان)- (ديفتري-كزاز-سياه سرفه) بله  خيرتاريخ آخرين دز: روز ماه سالواكسيناسيون قبلي (ديفتري-كزاز-خردسالان)-(ديفتري-كزاز بزرگسالان)- (ديفتري-كزاز-سياه سرفه) بله  خيرتاريخ آخرين دز: روز ماه سالموارد تماس با بيمار مشكوك به سياه سرفه: بله خيرموارد تماس با بيمار مشكوك به سياه سرفه: بله خيرموارد تماس با بيمار مشكوك به سياه سرفه: بله خيرموارد تماس با بيمار مشكوك به سياه سرفه: بله خير نوع نمونه هاي ارسالي:نمونه گرفته شده از نازوفارنکس روي محيط ترانسپورت سياه سرفه  نمونه سرم خون بيمار: نوع نمونه هاي ارسالي:نمونه گرفته شده از نازوفارنکس روي محيط ترانسپورت سياه سرفه  نمونه سرم خون بيمار:تاريخ نمونه برداري:روز ماه سالروز ماه سالتاريخ نمونه برداري:روز ماه سالروز ماه سالنام و نام خانوادگي فرد مسئول ارسال کننده نمونه: آدرس مركز: شماره تلفن : فاكس:نام و نام خانوادگي فرد مسئول ارسال کننده نمونه: آدرس مركز: شماره تلفن : فاكس:نام و نام خانوادگي فرد مسئول ارسال کننده نمونه: آدرس مركز: شماره تلفن : فاكس:نام و نام خانوادگي فرد مسئول ارسال کننده نمونه: آدرس مركز: شماره تلفن : فاكس:این قسمت توسط انستیتو پاستور تکمیل می گردد.:نام ونام خانوادگی فرد دریافت کننده نمونه: تاریخ دریافت نمونه:اشکالات نمونه ارسال شده:این قسمت توسط انستیتو پاستور تکمیل می گردد.:نام ونام خانوادگی فرد دریافت کننده نمونه: تاریخ دریافت نمونه:اشکالات نمونه ارسال شده:این قسمت توسط انستیتو پاستور تکمیل می گردد.:نام ونام خانوادگی فرد دریافت کننده نمونه: تاریخ دریافت نمونه:اشکالات نمونه ارسال شده:این قسمت توسط انستیتو پاستور تکمیل می گردد.:نام ونام خانوادگی فرد دریافت کننده نمونه: تاریخ دریافت نمونه:اشکالات نمونه ارسال شده:نشاني: تهران- خيابان پاستور-پلاك 69 – كدپستي 13164- انستیتو پاستور ایران– بخش ميكروبشناسيتلفکس: 66405535 - روزهاي تعطيل 20- 66953311نشاني: تهران- خيابان پاستور-پلاك 69 – كدپستي 13164- انستیتو پاستور ایران– بخش ميكروبشناسيتلفکس: 66405535 - روزهاي تعطيل 20- 66953311نشاني: تهران- خيابان پاستور-پلاك 69 – كدپستي 13164- انستیتو پاستور ایران– بخش ميكروبشناسيتلفکس: 66405535 - روزهاي تعطيل 20- 66953311نشاني: تهران- خيابان پاستور-پلاك 69 – كدپستي 13164- انستیتو پاستور ایران– بخش ميكروبشناسيتلفکس: 66405535 - روزهاي تعطيل 20- 66953311

اسلاید 27: اشتباهات معمول پرسنل در نمونه برداری خطا در برچسب زدن نمونه ها خطا در پر کردن صحیح اطلاعات لازم در فرم مربوط به بیمار مناسب نبودن مقدار نمونه جهت انجام آزمایش و بدست اوردن نتایج قابل قبول خطا در انتخاب محیط ترانسپورت مناسب (specific, leak proof, unbreakable, sterile) آماده نکردن و عدم آموزش بیمار قبل از نمونه برداری محکم نبستن در محیط ترانسپورت که منجر به بیرون ریختن و در نتیجه آلودگی می شود رعایت نکردن شرایط نگهداری نمونه و ارسال آن در مدت زمان صحیح

اسلاید 28: كشتروش استاندارد طلايي در ميان روشهاي آزمايشگاهي است كشت نمونه هاي ارسالي بر روي محيط برده ژانگو و رگان لو(با سفالكسين و بدون سفالكسين) انكوباسيون در °C37-35 و كنترل كشت باكتري تا 9 روز در شرايط مناسب همراه با رطوبت در صورت رشد باكتري بر روي محيط، تهيه اسمير از كلني هاي مشكوك و رنگ آميزي گرم در صورت مشاهده كوكوباسيلهاي گرم منفي: انجام تستهاي تشخيصي اكسيداز (+) و حركت (-) و APIانجام تست اسلايد آگلوتيناسيون با استفاده از آنتي سرمهاي پلي كلونال براي تاييد باكتري بوردتلا پرتوسيس و پارا پرتوسيس

اسلاید 29: محيط برده ‍ژانگواولين محيط براي رشد باكتري بوردتلا پرتوسيسحاوی سفالکسین و بدون سفالکسینشامل:عصاره سیب زمینی، 1% گلیسرول و 15% خون دفيبرينه گوسفنديكلني هاي كوچك، براق و مرواريد مانند

اسلاید 30: محيط رگان لو (رگان لو شاركل آگار)محيط مناسب ترانسپورت براي گونه هاي بوردتلاحاوي سفالكسينشامل:عصاره گوشت، كازئين هضم شده با آنزيمهايپانكراتيك، نشاسته، ذغال فعال، نياسين و 10%خون دفيبرينه حیوانی

اسلاید 31: سرولوژي عبارت است از تعيين تيتر آنتي بادي (IgG and IgA) ايجاد شده بر عليه آنتی ژنهای توکسین بوردتلا پرتوسيس و FHA(Filamentous hemagglutinin) در سرم خون فرد بيماراين تست بيانگر حضور آنتي بادي در خون چه در اثر ابتلا به بيماري و چه در اثر واكسيناسيون است (بنابراين هم در افراد مبتلا و هم در افراد واكسينه نتيجه مثبت خواهد داشت) براي افراد بالاي 11 سال صورت مي گيرد و در صورت منفي بودن كشت و PCR پيشنهاد مي شود سرولوژی

اسلاید 32: به دليل توليد آنتي بادي در فرد واكسينه جهت بررسی افزایش میزان IgG , IgA در اثر ابتلا به بیماری، در تست سرولوژی به دو نمونه سرم نیاز است.بهترین تست سرولوژی مربوط به تیتر آنتی بادی IgG علیه توکسین پرتوسیس (PT) است که ویژه بوردتلا پرتوسیس بوده بیانگر ایجاد بیماری حاد در فرد مبتلا می باشد. (EU/ml 125-100 )در 3-2 هفته زمان سرفه کردن بیمار استفاده از هر دو روش سرولوژی و PCR پیشنهاد می شود.

اسلاید 33: آنتي بادي فلورسنت مستقيم (Direct Fluorescent Antibody (DFA معايب حساسيت پايين (78-18%) نياز به تعداد زياد باكتري (>104 CFU/ml) مناسب در مراحل اوليه بيماري نياز به مهارت و تجربه در استفاده از ميكروسكوپ آنتي بيوتيك درماني بر اتصال آنتي باديها ي فلورسنت بر ديواره سلولي باكتري موثر است اختصاصيت پايين ( 44-7%) مثبت كاذبمزاياسريعتر از كشت

اسلاید 34: عبارت است از تكثير ناحيه بسيار اختصاصي از ژنوم باكتري با استفاده از پرایمر و پروب اختصاصیReal-Time PCR

اسلاید 35: بهترين و دقیقترین تست تشخيصيزمان كوتاه مورد نیاز جهت ارائه نتایجحساسيت بالا (<= (1CFU/ 5 µl sample)اختصاصيت بالا عدم نياز به باكتري زنده (مشكلات ناشي از نمونه گيري و طريقه انتقال نمونه را ندارد)مزایای real-time PCR نسبت به کشت

اسلاید 36: نیاز به آماده سازی DNA باکتری نياز به وسايل و تجهيزات دقيقهزينه بسيار بيشتر از روش كشت و DFA عدم استاندارد سازي اين روشبازدارنده هاي PCR واكنش متقاطع با گونه هاي ديگر باكتري مانند B. bronchiseptica, B. holmesii, در صورت استفاده از IS481معايب Real Time PCR استفاده از روش ملکولی جایگزین که هزینه کمتری داشته وامکان استفاده از آن در سراسر کشورفراهم باشد

اسلاید 37: آيا سياه سرفه قابل پيشگيري و درمان است؟آنتي بيوتيكواكسيناسيونكموپروفيلاكسي

اسلاید 38: وضعیت موارد ارسالی مشکوک به سياه سرفه به انستیتو پاستور ایران طی سالهای1386-1391

اسلاید 39: موارد کشت مثبت سیاه سرفه از سال 1392-1386

اسلاید 40: اشکالاتمصرف آنتی بیوتیکواکسینه شدهکشت مثبتاستان49613آذربایجان شرقی0001البرز0445تهران0112خراسان رضوی1نامشخصنامشخص1خراسان شمالی0011زنجان0111قم0111کرمانشاه0245مازندران1نامشخصنامشخص1نامشخصموارد کشت مثبت سال 1392

اسلاید 41: موارد مثبت سیاه سرفه از نظر گروه های سنی بیماران (1392)

اسلاید 42: اشكالات معمول در موارد ارسالييك سوابسواب پنبه ايبدون ترانسپورتبدون سواببدون فرمآ لودگی محیطفقط سرم ارسال شده استفرم دیفتری پر شده استنقص در تکمیل فرمبی نام وشماره تماساستفاده از محیط ترانسپورت تاریخ گذشتهتاخیر در ارسال نمونه

اسلاید 43: اشکالات مربوط به نمونه های ارسالی امسال تا اسفند ماه 1392