کاربرد الکتروفورزیس در PCR

کاربرد الکتروفورزیس در PCR

اسلاید 1: کاربرد الکتروفورزیس در PCRمحمداحمدی

اسلاید 2: در پایان یک PCR ما محصول PCR را خواهیم داشت که در صورتی که ژن مورد نظر در محیط موجود بوده باشد، پرایمرهای اضافه شده به آن متصل شده و در نتیجه ما شاهد تعداد کپی های فراوانی از آن ژن هستیم. اما چگونه می توانیم مشاهده کنیم که در محصول PCR ما ژن مورد نظر موجود است؟

اسلاید 3: روش معمول بررسی محصولات PCR بردن نمونه ها روی یک ژل آگارز و الکتروفورز است. در هنگام الکتروفورز، قطعات تکثیر، شده که به واسطه گروه های فسفات دارای بار منفی هستند، در منافذ ژل آگاروز به سمت قطب مثبت حرکت می کنند و بر اساس وزن مولکولی از یکدیگر تفکیک می شوند.

اسلاید 4:

اسلاید 5: پس از اتمام الکتروفورز محصولات با رنگ های شیمیایی همچون اتیدیوم بروماید (Ethidium bromide) به شکل باند قابل رویت می گردند. رنگ های متیلن بلو یا کارولینا بلو هم می توانند جایگزین اتیدیوم بروماید شوند، اما به دلیل حساسیت و سرعت رنگ آمیزی، علی رغم جهش زا بودن، اتیدیوم بروماید ترجیح داده می شود. مقایسه اندازه باند ظاهر شده با یک استاندارد وزن مولکولی DNA-ladder میزان موفقیت واکنش را آشکار می سازد.

اسلاید 6:

اسلاید 7:

اسلاید 8: درصد ژل اگارز بسته با سایز باند ژن مربوطه متفاوت خواهد بود

اسلاید 9: پس از ساختن درصد ژل مورد نظر از آن جایی که محصول PCR بدون رنگ است آن را با یک رنگ مخلوط کرده و در شانه های موجود در ژل اضافه می کنیم. این ژل در مایعی با PH خاص قرار دارد و از سمت قطب منفی به سمت قطب مثبت است و بنابراین می تواند محصول PCR روی آن حرکت کند.  اگر اندازه باند تکثیر شده دور از انتظار باشد، نشان از وجود محصولات غیر اختصاصی می دهد. این محصولات می توانند در نتیجه ورود آلودگی یا خطای جفت شدن ایجاد شوند. آلودگی ممکن است از سطح میزهای آزمایشگاهی و وسایل آزمایشگاه، سمپلرها، ذرات معلق در هوا از قبیل باکتری ها و یا حتی تکه ای بافت از قبیل پوست و مو، و یا استفاده از محلولهای آلوده وارد مخلوط واکنش PCR شود.  خطای جفت شدن زمانی رخ می دهد که پرایمر ها درحین جستجوی توالی مکمل خود روی رشته هدف، به نواحی متصل شوند که تنها مکمل بخشی از توالی آن ها باشند، و سپس این قطعه توسط آنزیم DNA پلیمراز ساخته شود. این محصول می تواند در چرخه های بعد هم به همین منوال تکثیر شود و باعث به وجود آمدن محصول غیر اختصاصی واکنش PCR شود.