استخراج RNA از بافت و تشکیل CDNA

استخراج RNA از بافت و تشکیل CDNA

اسلاید 1: ***به نام آفریننده شگفتی ها***مدرس : آقای دکتر حسین یزدیارائه دهنده : احمدرضا نجاری چگونگی استخراج RNA از بافت سنتز CDNA

اسلاید 2: ساختمان DNA وRNA

اسلاید 3: استخراج RNA از بافت: 30mlg از بافت مورد نظر را همراه با ازت مایع در هاون خرد میکنیم تا به صورت پودر در بیاید

اسلاید 4: یک میلی لیتر rna x plus را به بافت خشک شده اضافه میکنیم و به ویال 1.5 میلی لیتری انتقال میدهیم این مخلوط را به مدت 5 الی 10 دقیقه با ورتکس کردن هموژن کرده و 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه میکینیم200 لاندا کلروفرم به ویال اضافه میکنیم15 ثانیه ویال را تکان داده (ورتکس نگردد)سپس ویال 10 دقیقه روی یخ انکوبه میکنیم ویال تا در دمای 4 درجه c با دور 12000RPmبه مدت 15 الی 30 دقیقه سانتریفیوژ میشود

اسلاید 5: در این مرحله 3 فاز به وچود میاید :فاز ابی بالایی شامل RNA بوده فاز میانی سفید رنگ شامل DNA بوده فاز پایینی هم شامل باقی اجزای سلولی (پروتئینی)

اسلاید 6: با احتیاط به گونه ای که فاز میانی برداشته نشود از فاز ابی (رویی) برداشته و به یک ویال جدید 1.5 م.ل اضافه میکنیم سپس هم حجم با مقدار فاز ابی ایزوپروپونال به ویال اضافه میکنیمویال را به شدت تکان داده و 10-15 دقیقه در دمای منفی 20به منظور رسوب دادن RNAانکوبه میکنیمسپس ویال را به مدت 15-30دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ میکنیم بعد محلول رویی را دور ریخته و چند دقیقه در دمای اتاق انکوبه میکنیم تا الکل ان بخار شود برحسب میزان رسوب حدودا 20-50 لاندا اب دپس ( depc) به رسوب اضافه میکنیم در مرحله بعد RNA استخراج شده در الکتروفورز همراه با ژل آگارز پلی اکریل امید (PAGE) مورد بررسی قرار میگیرد