اصول آماده سازی نمونه و پروسسینگ در آزمایشگاه و تهیه لام

صفحه 1:


صفحه 2:
* تمام مراحل كاري از ابتداي پذیرش نمونه درآزمایشگاه پاتولوژي تا آماده سازي لام و بررسي آن در زیرمیکروسکوب به عنوان روش هاي تكنيكي آسیب شناسي در نظر گرفته مي‌شود که شامل هفت مرحله جداگانه است: 1) فیکساسیون, نمونه ‎Re‏ يا ‎ot‏ دادن 4) آبگيري و آغشتگي 4) قالب‌گيري, 5) برش با میکروتوم, 6) رنگ‌آميزي و 7 مونتاژ لام و لامل . 

صفحه 3:
1) فیکساسیون (8211018) * این مرحله صرفا"جهت حفظ ساختمان فيزيكي بافت و براي جلوگيري از رس ‎yl (Autolysis)‏ انجام مي‌شود. * نمونه جراحي شده بايد بلافاصله درون ماده فيكساتيو قرار بكيرد. * مايع يايداركننده يا فيكساتيو: * باید سلول زنده را هر چه سریعتر کشته و به سرعت در بافقت نفوذ نماید و در صورت امکان ساختمان طبيعي سلول و بافت را تغییر ندهد و همچنین بعضي از مواد نیمه ماع و كلوئيدي را با عمل فیکساسیون تبدیل به مواد نیمه جامد (96۱ (کند . * در مجموع ماده فیکساتیو را باید طوري انتخاب کرد که در بافت و همچنین در آن خللي ایجاد نکند. * براي انجام این کار فيكساتيوهاي مختلفي وجود دارد ولي ‎formalin is 37% formaldehyde by weight (40% by volume), *‏ ‎methanol, and the rest water‏ 6-13%. * زمان ماندن نمونه در فرمالین (فرم آلدئید): 7 بسكي به حجم و نوم موه ار ‎٠‏ معمولا" نمونه‌ها را 24 ساعت در فرمالین قرار مي‌دهند. 

صفحه 4:
REMARKS The volume of fixative shout be at least aatimas of the volume of the specimen. Immerse smears immediately into alcohol. Cytospray fixative is acceptable. Send fresh without fixatives during office hours. FIXATIVE 10% buffered formalin wet-fixed in 95% ethyl alcohol Equal volume of 4 ethyl alcohol SPECIMEN Biopsies and Surgical specimens Direct smears e.g. Cervical smears, bronchial brushings Body fluid 

صفحه 5:
* نمونه‌هايي مانند استخوان, دندان و به طور کلي بافت هايي که دازاي _ رسویات آهكي باشد بایدپیش از افیکساسیون, دکلسیفیه شود تا بتوان/آن زا براي مراحل بعدي ۵ ۲9 ‎٠‏ وفاسيفعاسيوت کی ار كردن جوا ‎(acu) Soest‏ از جاقت استخوانی وال حراعل زیر اشتز الق) نویه تسوج )کون )کلم بفیکاسیون ۱۳۳۲۲۶ خنثي کردن ه) شستشو با آب ‏ولو کلسیسیکاسیون باید داراي حصوصیای زیر باشد؛ | ‎Intel]‏ 1 طور كل ار ای ار ‏ب) به بافت اصلي آسيبي وارد نکند و ‏واور ره احتلال اتاد کی 

صفحه 6:
Decalcifying agents + There are three main types of decalcifying agents: + Those based on strong mineral acids ۶ + Those based on weaker organic acids » Those composed of chelating agents 

صفحه 7:
‘Comment Rapid in action, exceeding end- point wil impair staining. A traditional decaleffier that decalcifies more slowly than ‘aqueous nitric acid. Quite rapid in action, exceeding end-point wil impair staining. Formain should be washed from specimen before placing in HCI to avoid the formation of bis- chloromethyl ether (a carcinogen). Rapid in action, exceeding end-point will impair staining. Rapid in action, exceeding end- point will impair staining. ‘Sodium chloride saturated soln. = / Table 1: Mineral acid decalcifiers Decalcifier | Formula Nitric acid | 5% in distiled water Perenyi’s fluid® (1882) 10% nitric acid 40m! 0.5% chromic acid 30mi Absolute alcohol 30mi Hydrochloric acid? | 5-10% in distiled water Von Ebner’s solution® 50۳ Distilled water 42m! Hydrochloric acid 8mi 

صفحه 8:
2) نمونه برداري يا پاس دادن: * براي اجراي این مرحله, نمونه باید از لحاظ اندازه کاملا" مناسب باشد. ۰ چنانچه نمونه بزرگتر از حد معمول باشد مواد آبگیر مانند گزیلول, الکل و . نمي‌تواند در آن نفوذ کند و ۰ مس ام 0 ۶ خواهد شد. ‎A specimen should not be more than 4 mm thick. Ideally -‏ ‎a3 mm thick slice should provide excellent fixation and‏ ‎processing. It is useful to remember that the specimen‏ ‎.cavity in a standard processing cassette is 5 mm deep‏ * براي هر کدام از نمونه‌ها پاید مشخصات پافت را به‌طور کامل گزارش کرد ابن مشخصات شامل: حالت. ابعاد. ضخامت, رك ترشحات. و.. اسك. و براي جداکردن نمونه‌ا از يكديكر و شناسايي آنها بايد شماره تشه هفراه با سال تخوه‌برداری را هه مداد ری کات تمه و کراه باباف داخل طروف معموص ‎Eisele ke‏ بعدي آماده کرد 

صفحه 9:
و میز پاس همراه با وسایل مربوطه 

صفحه 10:
که شامل دوازده ظرف حاوي محلول هاي مختلف است. این محلول‌ها 3 وظیفه پر عهده دارد: الف) آيگيري, ب) شفاف کردن و ج) ‎iat‏ با پارافین حجم كلي هر ظرف 1000ميلي لبتر است و ترتیب آنها بدین صورت است: ‎ve‏ "مونه برش راو شده حدود 3 ساعت در فرمالین قرار مي‌گیرد. ۱ اشكالي ایجاد نمي‌کند ). در بعضي موارد. در ظرف شماره 2 به جأي فرمالین از آب فقظر استفاده مي‌شود. مذت رمان قرار گرفتن تمونه در آب مقطر یک ساعت ‏است. ‏7 شامل ‎cul‏ ظرف شماره 3 الكل 9070و ظرف شماره 4 الكل 9080. ظرف شماره 5 الكل 0 و ظرف شماره 6 الكل 97096 است. علت صعودي انتخاب كردن اين الکل‌ها این است که آب‌گيري به آرامي انجام شود. زمان قرار گرفتن نمونه در هر كداة از اين الکل‌ها یک ساعت است. به طور کلی آناتول بهتر از متاتول 1 ‎ ‏مي‌کند ‎oly‏ به علت هزینهبالات, از متانول اشتفاده مي‌شود. در کین حال متنول خاصيت رنكبري هم دارد. اين مرحله بسيار مهم است و با الكل به خوبي انجام نشود مراحل بعدي نيز دجار اشكال شده وسبب 0 بافتها خواهد ‎7 ‎ ‏8 ‏ای مد ده کی اه ارت ار ور اراد 

صفحه 11:
است. پارا در دما أرما شاه جامد ار رسد براي همین منظیی 9۵ اراي المنتي است كه باع توليد حرارت در ظرقة 5 51153 و3 مرانشود: بعد از اينكة تمه داخل ارافين عداب قرا 1575 كاذه داخل باقت تقود كردة :و بافت‌به حالت آعشتگ 05 راف در شكاف و درن ناقت تفوة مي‌کند و دردماي ازمانشگاه الت رق تحب شدورو قايل يرشنا متكرزوتوه كواهد شد لار 1 ذكر ]نك كه ماده آغشتگي با ماوه قالبكيري بايد يكي باشد” دستكاه تيشو يروسسور مجهز به دكمه هاي خودكار تنظيم زمان (1۳06۲(, دکمه‌هاي روشن و خاموش و بالا 5 و جرخشي و چراغ‌هايي براي اطمینان از روشن بودن د حت كا" ا د ان سكل اتات اس تا مولا" دوي 020038 طول مي‌کشد که یک سیکل کامل شود" 

صفحه 12:
دستگاه تیشوپروسسور 

صفحه 13:


صفحه 14:
4( قالب‌گيري : ۰ براي قالب‌گيري باید ماده آغشتگي (پارافین) را در دماي 60 درجه سانتي گراد داخل فور ذوب کرده و مقداري موم به نسبت 1 یه 10 به آن اضافه کرد از عوم بزاي قالب‌گيري استفاده مي‌شود در صورعگ فقط از پارافین انستفاده شود قالب‌ها بسیار شکنده خواهند شد پش از این مرحله كار رو تموته‌ها وارد مسیر جديدي مي‌شود که شامل قا ي» برش و رنگ‌آميزي و در نهایت نتاژ لام و لامل است. ‎oe‏ ‏قالب‌گيري باید نمونه‌هاي آبگيري شده را به وسیله پنست داخل ظرف مخصوص قالب‌گيري قرار داده, روي آن محلول موم و پارافین ریخت و بعد از گذشت چند دقیقه شماره نمونه‌ها را زوي آن‌ها فرار داد این عمل در اصطلاح کوله کرون تتونه‌ها لأميدة مي‌شود و تباز یه دقت کافي داره بر تن ین مرحله قالب‌ها تا شروع زمان برش داحل بخجال قزر مي‌گیرد. 

صفحه 15:
رنگ آمیزی و اصول تهیه لام ۱ 

صفحه 16:
5) برش با میکروتوم : * در این مرحله نمونه‌هاي قالب‌گيري شده را به وسیله میکروتوم به ضخامت 5 میکرون برش مي‌دهند. رای شروع اج عرحله ‎٠.‏ اد حداگاته انا تم این دستگاهه و وسایل شامل: میکروتوم, تیشوفلوت, چراغ مطالعه و قلم الماس است. 

صفحه 17:
5-1) میکروتوم: دستكاهي است كه از آن براي تهيه برش هاي فانک اراك ل به صورت 7 ‎corel‏ استفاده کند. ین ‎ieee‏ داراي توانای در ضخامت‌هاي يرش بات اسث ميكروتوم موجود در آزمايشكادها 22 ا بو دواري است که براي برش بهتر لازم است نمونه‌ها را حدود یک دقيقه روي يخ قرار داد؛ البته سح ده مها ازنوع انجمادي ست 2 از داخل ‎ee‏ و اين گاز ایجاد سرما مي‌کند و برش بافتها به ود بدخور در انيما ۲ مي ثيرد. 

صفحه 18:
لن را به دو بخش بيروني و دروني تقسیم مي * در بخل درجتی گام رت سای مختلفي تعبیه شده است که به وسیله دسته میکروتوم به چرخش در مي‌آید و میله تنظیم ومتر, درجه تنظيمي را به داخل منتقل مي‌کند. با چرخش دسته مي‌توان برش هايي به وه اجه ‎coi‏ دستگاه شامل دسته, گیره ‎AS easel‏ زاویه بلوک, جاي نگهدارنده ‎gee‏ میکروتوم. پیچ تنظیم کننده زاف تيغ روتوم درجه ومتر و پیج یا دسته ‎Sst‏ وه وت مت اس بر روت سته. ميله‌اي تعبیه شده که به‌وسیله آن مي‌توان دسته را قفل نموده تا کاملا ثابت شود و بدین‌وسیله احتمال آسیب به دست یا خراب شدن بلوک کم مي‌شود ‎ 

صفحه 19:
این ذنتگاه در واقع ظرفي اس کهدز لبلب وه ۱۳ قسمتی در زير با ‎IGE‏ ‏ی قرارگیری گرمکن دسگاه است و بووسيلة کلب كدرل كد دمای 1۳ ‎Lain tage‏ می‌ شور كله این ا امین اطرافنموند نك ارد لازم به توضيخ است که داخل ‎Bes‏ بايد تبره ناد ‎ou‏ ‏وس تفلون يآ 0 كر 59 اه پوشانده مي‌شود. ‎eee‏ ‏انس رشگاه برای برظره جين وچروک بافت هاي برش خورده است. ‎ai (5-2‏ تیشوفلوت ‎ 

صفحه 20:
* با قرار دادن برش هاى حاصل از كر روى سطع مایع درون تیشو فلوت . چین و چروک برش ها را باز می کنیم . برای انجاماین کار باید به نکات زیر توجه شود : ۰ - آب درون تیشو فلوت از درجه حرارت مناسب (0-۱۰ درجه سانتیگراد از درجه ذوب پارافین ) برخوردار باشد. ۰ برش به نرمی و به مدت کافی ( حداقل ۳۰ ثانیه) روی آن قرارگیرد. 8 نوترابت مقدار 4 الكل کم سول باز شدن جین هاءاضافه دد. ‎Jas‏ صعی دهای بش فلو ] لي دناس جذاكانه. جهت خنطا باقت برش خورده , جلوگیری از ذوب پارافین و از هم تس ارم 

صفحه 21:
3 را مطالعه: * اين وسيله بر روي وي ميكروتوم و آب و الكل و تیشوفلوت احاطه منود في آن از خستگي مفرط چشم ي مي كد 

صفحه 22:
5-4) قلم الماس: * همان‌طور که از نامش پیداست. براي نوشتن به کار ۳ ‎jal,‏ نوک قلم باید از الماس باشد تا بتواند شمایه نمونه‌ها را خواتا روي لام که جحس شيشه دارد 

صفحه 23:
6) رنگ‌آميزي بافت‌ها : * این مرحله شامل دو نوع وتین و اختصاصي است: 13 آميزي روتین: روش رنگآميزي که در آزمايشگاه‌هاي پاتولوژي به طور معمول و روتین استفاده مي‌شود. و اتوکسیلین- ائوزین است. با این روش هسته سلوا بنفش و سیتوپلاسم رنگ صورتي به خود مي‌گیرد. 

صفحه 24:
دیاین رنگ‌آمیزی, ابتا تا کول و است که براي شکاف ساي و از بین بردن پارافین باقي مانده در اطراف بافت‌ها استفاده مي‌شود. نمونه‌ها در هر ظرف گزیلول به مدت 5 دقیقه قرار داده مي‌شود. ”بعد از گزیلول 4 ظرف الکل درجه بندي شده قرار دارد. نمونه‌ها را در هل كدام به مدت 1-2 دقیقه گذاشته و بعد با آب شستشو دآده مي‌شود و بعد بلافاصله در ظرف حاوي هماتوکسیلین قرار مي‌گیرد. ۰ ¥ زمان قرار گرفتن در هماتوکسیلین 10-15 دقیقه است که این زمان ‎eee‏ هرن نک دار 

صفحه 25:
“لازم است بعد از اين مرحله نمونهها با آب شستشو داده شده و بافت هاي اضافی اطراف آنها ]09710 “بعد از تميز كردن لامهاء آن‌ها را داخل اسید الکل شناور کرده تا رنگ هاي اضافي داخل بافت از بين برود. “يعد از اسيد الكل نوبت به كربنات كلسيم ميرسد. وظيفه اين محلول, رنگ‌آميزي زمینه بافت است و باعث مي‌شود هسته آبي به نظر برسد. 

صفحه 26:
"ظرف بعدي ائوزین است که باعث قرمز شدن سیتوپلاسم مي‌گردد. بعد از جند ثانيه که نمونه ها داخل ائوزین قرار گرفت آن‌ها را با آب شستشو داده. يعد به ترترب 40215 قارف الكل قرار ميكيرد. اين الككرها هم درجه بندي شده و به ترتیب 90-80-70 و 96درجه است و بافت‌ها دز هر کدام, حدود 3-5 ثانیه قرار مي‌گیرد. ۷ ظرف آخر شامل گزیلول است که براي شفاف تر شدن بافت‌ها ات مي‌شود. زمان قرارگيري نمونه‌ها درگزیلول در حدود 3-5دقیقه ست. #۳ 

صفحه 27:
رت اسر ی اختصاصي: * در این رنگ آمیزی هر جزء از سلول رنگ خاصی به خود می‌گیرد. رنگ آمیزی اختصاصی شامل: ۳- رنگا ‎RO ee ice‏ 1 ۶ ۴- رنگ آمیزی برای برخی مواد سیتوپلاسمیک. ۵- رنگ آمیزی برای آنزیم‌ها, ی برای میکروارگانیسم‌ها و بیزی سیتولوژیک. رنگ آمیزی‌های اختصاصی دارای روش‌های مختلفی است که هر کدام توسط پزشک معالج درخواست و در آزمایشگاه پاتولوژی بسته به شرایط موجود انجام می‌شود. 

صفحه 28:
ظروف رنگ اميزي 

صفحه 29:
از آنجا که قدمت رنگ و میزان استفاده از آن, به علت تغيير نام درف همچنین گریستالیزه با آلوده شدن بر رنگ پذیری بافت شرمی کدارد. رنگهای کور داشفاد بابر متناسب با حهم كارك تر و تعونض گردند و سوابق آن حفظ گردد 

صفحه 30:
»براي این کارابتدا لازم است پشت لام‌ها را خشک کرده و بعد لاملي را که قبلا زوین یک تاد و قظری تست محضوض ‎aay‏ شده؛ با پتس روي لام قرار داد. بعد اطراق لام را كاملا" تمیز کرده و اجازه دادعا در دماي آزمایشگاه خشک شود. در آخر ۶ شماره نمونه‌ها روي برچسب نوشته شده و با دقت روي لام‌ها قده مي‌ شود شپس لامها همران بآ ‎Se‏ در خواست آنها در اختیار پاتولوژیست براي تشخیص نهايي قرار 

صفحه 31:


صفحه 32: